周穎璐 ， 高 琛 ， 姜忠玲 ， 王 新 ， 叢 霞 ， 曹榮峰 ， 李華濤 ， 田文儒

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

高溫是造成動物生殖機能降低的重要環(huán)境因素，環(huán)境溫度超過體溫調(diào)節(jié)能力時，家畜體溫升高，并常伴隨著機體的氧化損傷。卵巢氧化應(yīng)激影響卵母細胞成熟、卵子的發(fā)育，甚至造成卵泡閉鎖、細胞凋亡等。氧化應(yīng)激時，過多的ROS可激活多條信號通路，調(diào)控細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factors 2，Nrf2)是細胞對抗外來化合物及氧化損傷最重要的核轉(zhuǎn)錄因子[1]。Nrf2/KEAP1系統(tǒng)是氧化應(yīng)激的感受器[2]，Nrf2/KEAP1信號途徑失調(diào)將加重氧化應(yīng)激損傷。黃芩苷是良好的抗氧化劑，但是黃芩苷對熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠卵巢氧化損傷和細胞凋亡的保護研究尚未見報道。本研究主要集中于黃芩苷對熱應(yīng)激小鼠卵巢氧化損傷指標、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達以及相關(guān)凋亡蛋白的表達揭示黃芩苷是否減少熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠卵巢氧化損傷和細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及熱應(yīng)激處理 6～7周齡雌性昆明系小鼠，體重25±0.5 g，按光照/黑暗=14 h/10 h控光，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后用于試驗。分組與熱應(yīng)激按參考文獻[3-4]方法處理。

1.2 樣品采集和處理 熱應(yīng)激處理2 h后，斷頸處死小鼠，剖腹取卵巢組織，一側(cè)卵巢投入10%中性福爾馬林中固定，做H.E.染色及免疫組化，另一側(cè)凍存于-80 ℃冰箱中，用于制備組織勻漿以及提取總蛋白。

1.2.1 卵巢組織勻漿制備及蛋白濃度的測定 稱重卵巢組織并按重量∶體積=1∶19加入生理鹽水，制成5%組織勻漿，并在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，用Bradford法測定其上清中組織蛋白濃度。

1.2.2 組織總蛋白提取 稱重卵巢組織并按重量∶體積=1∶10比例加入RIPA裂解液。用電動組織勻漿研磨器研磨至充分裂解，然后以12 000 r/min 離心5 min，將上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 卵巢切片組織學(xué)觀察 將卵巢組織浸泡于體積分數(shù)為10%中性福爾馬林中，24 h后，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯處理后做石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，經(jīng)H.E.染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢的組織學(xué)變化。

1.4 檢測MDA和NO含量及SOD、GSH-Px和CAT活性 MDA、NO、SOD、GSH-Px和CAT分別用相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定，操作過程嚴格按試劑盒說明書進行，依次加入相應(yīng)量的卵巢組織勻漿和試劑，最后在紫外可見分光光度計上進行測定。

1.5 卵巢組織中Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1檢測 提取各組小鼠卵巢組織總蛋白，混合等體積2×SDS樣品緩沖液，加熱變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，在4 ℃條件下220 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h，10% BSA室溫封閉2 h，4 ℃條件下一抗(1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，用Easy See Western Blot Kit試劑盒暗室內(nèi)化學(xué)發(fā)光，最后用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.6 免疫組化法檢測卵巢組織中Bcl-2、Bax、Caspase 3蛋白表達 對石蠟包埋的卵巢組織切片，二甲苯脫蠟，采用SABC法進行免疫組化檢測，其操作步驟按SABC試劑盒的說明書進行。陰性對照組用PBS代替首抗。對于染色后的切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，卵巢細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism 5.01軟件做統(tǒng)計學(xué)處理，組間差異用Dunnett單因素方差分析，均數(shù)間進行t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠卵巢組織H.E.染色變化 H.E.染色試驗結(jié)果表明，常溫對照組和黃芩苷組小鼠卵巢組織與卵泡細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。熱應(yīng)激組小鼠卵巢組織組織細胞排列疏松，組織間質(zhì)增寬，血管擴張并充滿血液，組織部分細胞著染增深。與熱應(yīng)激組相比熱應(yīng)激加黃芩苷組卵巢組織，其各部分細胞形態(tài)正常，與對照組無明顯差異(見中插彩版圖1)。

2.2 卵巢組織內(nèi)MDA和NO含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的變化 與常溫對照組相比，41 ℃熱應(yīng)激組中MDA(P<0.05)和NO(P<0.01)的含量均顯著增加，SOD、GSH-Px和CAT活力均極顯著降低(P<0.01)提示卵巢組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。與41℃熱應(yīng)激組相比，熱應(yīng)激加黃芩苷組中MDA和NO含量顯著降低(P<0.05)，SOD(P<0.01)、GSH-Px(P<0.05)和CAT(P<0.05)活性則顯著升高，抗氧化酶活性恢復(fù)。而熱應(yīng)激加黃芩苷組與常溫對照組和黃芩苷組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，提示黃芩苷能夠抑制熱應(yīng)激所致卵巢組織的氧化損傷(見圖2)。

圖2 黃芩苷對熱應(yīng)激小鼠卵巢組織內(nèi)MDA(A)和NO(B)含量及T-SOD(C)、GSH-Px(D)和CAT(E)活性的影響

*:P<0.05(與常溫對照組比差異顯著)； **:P<0.01(與常溫對照組比差異極顯著)；#:P<0.05(與41 ℃熱應(yīng)激組比差異顯著)

2.3 黃芩苷對熱應(yīng)激卵巢組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.3.1 黃芩苷對Nrf2和Keap1蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，41 ℃熱應(yīng)激后小鼠卵巢組織中Nrf2和Keap1的表達顯著增高(P<0.05)。而黃芩苷干預(yù)后Nrf2和Keap1表達顯著降低，并與常溫對照組和黃芩苷組相比無顯著差異(見圖3)。

圖3 Nrf2(A)和Keap1(B)在卵巢組織內(nèi)的表達

2.3.2 黃芩苷對HO-1和NQO1的表達的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，41℃熱應(yīng)激后小鼠卵巢組織中HO-1和NQO1的表達均顯著升高(P<0.05)；而與41℃熱應(yīng)激組相比，熱應(yīng)激加黃芩苷組HO-1和NQO1的表達顯著降低(P<0.05)，并與常溫對照組和黃芩苷組相比無顯著差異(見圖4)。

圖4 各組小鼠卵巢組織內(nèi)HO-1(A)和NQO1(B)蛋白的表達

2.4 免疫組化法檢測黃芩苷對熱應(yīng)激卵巢組織中Bax、Bcl-2、Caspase 3蛋白表達的影響 免疫組織化學(xué)的方法檢測Bax、Bcl-2和Caspase 3蛋白陽性反應(yīng)主要定位于細胞膜或細胞質(zhì)，染色呈淡黃色至棕黃色顆粒。與對照組相比，熱應(yīng)激能引起小鼠卵巢組織中Bax升高，特別是卵泡顆粒細胞棕黃色濃染；與熱應(yīng)激組相比，黃芩苷降低了熱應(yīng)激引起的卵泡顆粒細胞Bax表達。Bcl-2在正常卵巢組織中陽性表達，與對照組相比，熱應(yīng)激能降低卵泡顆粒細胞和間質(zhì)細胞中Bcl-2的表達；與熱應(yīng)激組相比，黃芩苷能顯著增加卵巢顆粒細胞與間質(zhì)細胞中Bcl-2的表達，表現(xiàn)棕黃色濃染。Caspase 3在正常組織中呈現(xiàn)陰性表達，與對照組相比，卵巢間質(zhì)細胞中Caspase 3深色黃染，呈現(xiàn)高表達，卵泡顆粒細胞中部分陽性表達；與熱應(yīng)激組相比，黃芩苷阻止熱應(yīng)激引起的Caspase 3表達，呈現(xiàn)陰性。

3 討論

熱應(yīng)激使機體產(chǎn)生ROS，產(chǎn)生氧化損傷[5]。氧化損傷是許多外源化合物導(dǎo)致機體毒性作用的主要早期分子機制之一，生物體內(nèi)ROS，包括NO等堆積是反應(yīng)機體氧化應(yīng)激狀態(tài)的直接證據(jù)。MDA是細胞內(nèi)產(chǎn)生的 ROS攻擊細胞生物膜上的多不飽和脂肪酸，致使細胞生物膜破壞而形成的。MDA顯著性增高提示機體氧平衡失調(diào)[6]。MDA高低可以間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究中，熱應(yīng)激小鼠卵巢組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)充血、水腫等現(xiàn)象。小鼠遭受熱應(yīng)激后卵巢組織中NO及MDA的含量增加，抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性降低，提示熱應(yīng)激誘導(dǎo)生成自由基進而降低動物抗氧化能力。李忠浩等研究發(fā)現(xiàn)，奶牛外周血液中SOD、GSH-Px的活性在夏季高溫季節(jié)極顯著下降，MDA含量極顯著上升[7]。熱應(yīng)激下公兔睪丸內(nèi)的SOD、CAT水平顯著下降[8]，即睪丸組織中抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致清除自由基的能力下降，自由基生成過多，睪丸組織細胞受損[9]。因此我們推斷小鼠抗氧化能力降低的同時氧化產(chǎn)物增多，小鼠卵巢發(fā)生氧化損傷。

在正常生理平衡下，Nrf2通過與 KEAP1相互作用并被蛋白酶降解而保存于細胞質(zhì)內(nèi)。當氧化應(yīng)激作用下，Nrf2/KEAP1之間的反應(yīng)被擾亂，導(dǎo)致Nrf2釋放并入核，隨后與MAF蛋白結(jié)合形成異二聚體，并與ARE結(jié)合，指導(dǎo)形成解毒酶、抗氧化蛋白及轉(zhuǎn)錄蛋白，從而起到細胞保護的作用[10]。在本研究中，小鼠遭受熱應(yīng)激后其卵巢組織中Nrf2的表達明顯增高，Keap1的含量也有所升高。分析其原因，熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠卵巢組織中促氧化物質(zhì)產(chǎn)生增多，刺激Nrf2表達上調(diào)，從而發(fā)揮其細胞保護作用，為了結(jié)合表達增多的Nrf2，組織細胞同時增加了Keap1的表達。同時，HO-1和NQO1的表達也明顯上調(diào)，可能是Nrf2通過與ARE及bZIP蛋白結(jié)合后啟動Ⅱ相解毒酶的表達。HO-1可以幫助神經(jīng)元抵抗氧化應(yīng)激損傷[11]。NQO1可增強C/EBPα 抵御20 S蛋白酶降解的穩(wěn)定性，有效抵抗輻射對骨髓的氧化損傷[12]。ARE相關(guān)基因的表達上調(diào)使機體能夠適應(yīng)內(nèi)環(huán)境ROS的積聚，證實KEAP1/Nrf2解聚可防御氧化應(yīng)激損傷。而通過激活 Nrf1/Nrf2途徑，可有效抑制 ROS的產(chǎn)生，以維持腎臟的功能[13]。雙酚A通過反式激活異型的Nrf1/Nrf2途徑，增加ARE靶基因HO-1、NQO1的表達，從而大大減少了人胚腎293細胞內(nèi)環(huán)境的ROS，起到抗氧化應(yīng)激的作用[14]。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，細胞受到氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡，H2O2處理鼠胸腺細胞可誘導(dǎo)細胞發(fā)生明顯的凋亡[15]。Bcl-2家族和Caspase家族在細胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極其重要的調(diào)控作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激能在一定程度上明顯的上調(diào)Bax,下調(diào)Bcl-2和Caspase 3蛋白水平。 Bax/Bcl-2比值可直接導(dǎo)致線粒體膜的功能紊亂，導(dǎo)致線粒體膜電位的丟失，以及促凋亡蛋白的釋放。Caspase與線粒體通路、死亡受體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路緊密相關(guān)。其中，Caspase與線粒體介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)。當線粒體受到凋亡信號的刺激，其釋放的Cyt-C能與Apaf-1及Caspase-9的復(fù)合物形成凋亡體，導(dǎo)致Caspase-9的自動活化 ，從而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase 3，最終導(dǎo)致凋亡。

黃芩苷對乙酰氨基酚和四氯化碳引起的肝脂質(zhì)過氧化損傷以及對鐵蛋白(或檸檬酸鐵)-亞硝酸鹽-過氧化氫體系造成的肝氧化損傷均有保護作用[16]。黃芩苷可以抑制熱應(yīng)激下LLC-PK1凋亡，其作用機制可能與影響凋亡基因Bax和Bcl-2表達有關(guān)[17]，這與研究三黃瀉心湯的主要成分黃芩苷對氧化損傷的保護作用機制相同[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預(yù)后小鼠卵巢組織其各部分細胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的病變。黃芩苷能夠抑制MDA和NO的生成，提高抗氧化酶濃度，反映黃芩苷干預(yù)后小鼠卵巢組織細胞受ROS損傷的程度降低，黃芩苷對氧化產(chǎn)物造成的卵巢組織損傷有保護作用。黃芩苷可以有效降低Bax和Caspase 3蛋白在卵巢細胞中的表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達水平，抑制卵巢細胞的凋亡。同時Nrf2、Keap1、HO1和NQO1的表達均下降，可能由于在黃芩苷的干預(yù)，機體氧化還原平衡逐漸恢復(fù)，Nrf2轉(zhuǎn)回入胞漿并通過泛素化降解，或者通過負反饋調(diào)節(jié)，促進Nrf2的消耗，Keap1、HO1和NQO1的消耗也同步增加，從而使抗氧化酶活性升高，清除自由基的能力增強，減少氧化產(chǎn)物的生成，緩解氧化應(yīng)激帶來的卵巢組織細胞凋亡。黃芩苷一方面通過其本身捕捉氧自由基，清除活性氧等氧化產(chǎn)物的能力，另一方面通過促進抗氧化酶的生成和Nrf2等蛋白的消耗來間接地使氧化產(chǎn)物濃度降低，保護組織不受損傷。因此可以推測，Nrf2/KEAP1信號通路可能參與黃芩苷抗氧化的過程。

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