柴　娟,孫沫逸,馬　超,李　昀,劉　寧,黃　碩

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔系口腔頜面外科教研室,西安　710021;2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科;*通訊作者,E-mail:chaijuan82@126.com)

頭頸惡性腫瘤包括唇癌、口腔癌、鼻腔癌、鼻竇癌、咽喉癌等,為世界第六大惡性腫瘤[1]。其中90%的頭頸惡性腫瘤為鱗狀細胞癌,其發(fā)生和發(fā)展主要是癌基因的存在和抑癌基因的缺失[2]。在全球惡性腫瘤中口腔鱗癌患者呈上升趨勢[3]。CD82也被稱為KAI1基因、R2抗原、C33、IA4、4F9。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)并證實,CD82與多種組織腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性[4-7]。為了研究基因CD82在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用,課題組在前期成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82[8],在本次實驗中將其轉(zhuǎn)染至OSCC-25細胞中,利用MTT、Transwell小室及Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗方法檢測其對OSCC-25細胞增殖、侵襲及周期的影響變化。

1　材料和方法

1.1　細胞株和質(zhì)粒

口腔鱗癌OSCC-25細胞購于美國菌種保藏中心ATCC,真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔頜面創(chuàng)傷實驗室所保存。

1.2　主要試劑

胎牛血清購自美國Sigma公司,DMEM培養(yǎng)基購自英國Oxoid,倒置相差顯微鏡購自國產(chǎn)Motic(型號AE31),FBS、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82課題組構(gòu)建,蛋白酶抑制劑RIPA裂解液購自加拿大Norgen Biotek公司,anti-CD82、二抗羊抗鼠IgG-HRP購自英國Abcam公司,GAPDH購自美國Santa公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自南京KGA公司(型號:KGA312)。Transwell小室購自美國Corning公司,6孔,孔徑8 μm。基底膜Matrige購自美國B.D公司。Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒購自上海Mbchem,型號M3021。

1.3　細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

實驗過程中,用8 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)OSCC-25細胞,并置于孵育箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察,當(dāng)90%的OSCC-25細胞聚縮靠攏,細胞間隙增大時,可傳代擴大培養(yǎng)。再將5×104的OSCC-25細胞接種在6孔板上,用含有FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml培養(yǎng),當(dāng)細胞長到80%時可以轉(zhuǎn)染。將稀釋的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82和LipofectamineTM2000混合均勻后,在室溫下孵育20 min,形成復(fù)合物后,按LipofectamineTM2000說明書要求,將其加入到培養(yǎng)基的孔中,再將培養(yǎng)板置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。分別于0,24,48,72 h用熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染數(shù)量。

1.4　蛋白質(zhì)印跡法檢測CD82蛋白的表達

收集OSCC-25細胞,加入蛋白酶抑制劑RIPA裂解液,按照試劑說明提取總蛋白后進行SDS-PAGE電泳以分離蛋白。將目的蛋白條帶電轉(zhuǎn)NC膜,用含5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗anti-CD82和二抗羊抗鼠IgG-HRP(稀釋濃度1 ∶2 000)各1 ml,室溫反應(yīng)1 h。按照電化學(xué)發(fā)光試劑盒說明顯影,以CD82蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5　MTT檢測細胞增殖實驗

在96孔培養(yǎng)板中加入約1×104細胞,并置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h,不同時間點收集細胞檢測。用Dilution Buffer將試劑盒中MTT稀釋后加200 μl DMSO后搖勻。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀以570 nm波長檢測每個孔的光密度。實驗分為3組:未轉(zhuǎn)染組為空白對照組,轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-EGFP為陰性對照組,轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-CD82組為實驗組。細胞增殖率(%)=(對照細胞OD值-受試孔OD值)/對照細胞OD值×100%。

1.6　Transwell檢測細胞侵襲實驗

轉(zhuǎn)染72 h,收集各組細胞,接種細胞于96孔板中,每孔接種細胞數(shù)約為5×105個,在Transwell小室的上室放置細胞懸液200 μl,下室放置500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。將其放于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，將濾紙用蘇木青染色10 min,再用95%乙醇溶液固定15 min,4 g/L結(jié)晶紫溶液進行染色5 s。400倍顯微鏡下觀察照相,隨機選取6個視野計數(shù)。實驗獨立重復(fù)3次。

1.7　Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測

轉(zhuǎn)染72 h,收集各組細胞,并用1×PBS洗滌。用100 μl含5% Annexin Ⅴ-FITC的標記液重懸細胞,并在暗處常溫下孵育15 min,每份標本中再加入10 μl PI染色。統(tǒng)計早期凋亡率(右下象限)和晚期凋亡率(右上象限)及總凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。

1.8　統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)保存在Window Excel數(shù)據(jù)庫,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果采用SPSS19.0軟件(美國SPSS公司)進行。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。組間比較選擇方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　口腔癌細胞OSCC-25中CD82的高表達

蛋白質(zhì)印跡法Western blot實驗檢測,隨著轉(zhuǎn)染時間的變化CD82在OSCC-25細胞中的表達量增加,在轉(zhuǎn)染后72 h CD82表達最強(見圖1),且與其他時間點比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且此時在免疫熒光鏡下可以觀察到超過90%的OSCC-25細胞中有CD82的表達(見圖2)。

2.2　過表達CD82基因后口腔癌OSCC-25細胞的增殖能力下降

MTT實驗方法測試各分組對OSCC-25細胞增殖能力的影響,時間分別為CD82基因轉(zhuǎn)染后0,24,48,72 h。每組實驗重復(fù)三次。實驗分析:陰性對照組與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)72 h,轉(zhuǎn)染實驗組的口腔癌OSCC-25細胞增殖活力明顯低于空白對照組及陰性對照組(均P<0.05)。實驗結(jié)果提示,過表達CD82基因可使口腔癌OSCC-25細胞的增殖能力明顯降低(見表1,圖3)。

圖1　CD82蛋白在OSCC-25細胞中的表達Figure 1　Protein expression of CD82 in transfected OSCC-25 cells

2.3　CD82基因過表達口腔鱗癌OSCC-25細胞的侵襲能力下降

Transwell侵襲實驗分析:空白對照組、陰性對照組和CD82轉(zhuǎn)染組的穿膜細胞數(shù)分別為43.7±4.5,42.8±3.4,25.1±3.2個;陰性對照組與空白對照組沒有明顯差異(P>0.05);過表達CD82基因后口腔鱗癌OSCC-25細胞穿過小室膜的細胞數(shù)明顯減少(見圖3),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4　CD82基因過表達促進口腔鱗癌OSCC-25細胞的凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測分析:右上象限是晚期凋亡和壞死的細胞百分比(晚期凋亡率),右下象限是早期凋亡的細胞的百分比(早期凋亡率)(見圖4)。陰性對照組與空白對照組相比,統(tǒng)計學(xué)沒有明顯差異(P>0.05);在培養(yǎng)72 h,轉(zhuǎn)染實驗組的口腔癌OSCC-25早期及晚期凋亡明顯高于空白對照組及陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

圖2　轉(zhuǎn)染72 h光學(xué)顯微鏡和熒光鏡CD82在OSCC-25細胞中的表達Figure 2　The protein expression of CD82 in transfected OSCC-25 cells under light and fluorescence microscope

表1各組MTT細胞增殖結(jié)果

Table1TheproliferationofOSCC-25inthedifferentgroups

組別0h24h48h72h 空白對照組0.3067±0.00640.3562±0.00810.4353±0.00530.7311±0.026 陰性對照組0.3061±0.00610.3621±0.00640.4331±0.00600.7321±0.035 轉(zhuǎn)染實驗組0.3042±0.00530.3433±0.00720.4217±0.00730.4713±0.012*

與其他兩組比較，*P<0.05

圖3　CD82轉(zhuǎn)染對OSCC-25細胞侵襲能力的影響(光鏡,×200)Figure 3　Effect of CD82 transfection on invasion of OSCC-25 cells (light microscope,×200)

圖4　CD82轉(zhuǎn)染對OSCC-25細胞凋亡的影響Figure 4　Effect of CD82 transfection on apoptosis of OSCC-25 cells

組別n右上象限右下象限空白對照組33.0±0.31.3±0.1陰性對照組33.0±0.11.1±0.1實驗組 36.4±0.2*2.3±0.1*

與其他兩組比較,*P<0.05

3　討論

TM4SF蛋白與腫瘤細胞的增殖、移動、融合及免疫系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)[9,10]。CD82是TM4SF蛋白家族中的主要成員之一,最先是在Dunning兔子前列腺癌模型中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[11],隨后很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)其與其他組織腫瘤細胞的表達和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。CD與其他跨膜蛋白、趨化因子相互作用可以調(diào)控腫瘤細胞的黏附、遷移和信號通路。

在本次實驗中,首先將pIRES2-EGFP-CD82質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到口腔鱗狀細胞癌OSCC-25中,在普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡中觀察到轉(zhuǎn)染72 h時,細胞轉(zhuǎn)染效率最高,為研究CD82在口腔鱗狀細胞癌OSCC-25生物學(xué)行為提供了實驗基礎(chǔ)。

Jee等[12]發(fā)現(xiàn)過表達CD82可以有效地抑制非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。Yang等[13]通過實驗發(fā)現(xiàn)過表達CD82可以抑制體外乳腺癌細胞侵襲和體內(nèi)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,但在國內(nèi)尚無報道過表達CD82會對口腔鱗狀細胞的生物學(xué)行為會有怎樣的影響。以往學(xué)者只是通過免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)CD82基因表達的缺失與口腔惡性腫瘤的發(fā)生、淋巴轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。Uzawa等[14]通過組織切片、免疫組織化學(xué)方法等發(fā)現(xiàn),CD82的下調(diào)存在于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性口腔鱗狀細胞癌中,且與淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。Kawasaki等[15]通過免疫組織化學(xué)方法亦發(fā)現(xiàn)CD82的表達與口腔癌原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位均有相關(guān)性。

MTT法是檢測細胞存活和生長的方法,在本實驗中,OSCC-25在轉(zhuǎn)染CD82后其細胞生長速度明顯較空白對照組和陰性對照組降低。表明過表達CD82后可以顯著抑制口腔鱗狀細胞的生長。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗可以區(qū)分凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)。本實驗中通過Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡法發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染CD82組使細胞的總凋亡率明顯上升且較其他組有明顯區(qū)別。由實驗可見過表達CD82后可以促進OSCC-25細胞的調(diào)亡。Transwell侵襲實驗用于檢測腫瘤細胞侵襲能力的實驗。轉(zhuǎn)染CD82使OSCC-25細胞的侵襲能力降低,且較其他組有明顯區(qū)別，說明過表達CD82能明顯抑制OSCC-25細胞的侵襲能力。

另外,過表達CD82也可以促進口腔鱗癌細胞的凋亡,可能也與一定的信號通路有關(guān)。Odintsova等[16]發(fā)現(xiàn)CD82與上皮細胞生長因子EGF誘導(dǎo)的信號通路有關(guān),且與EGF受體和跨膜蛋白有關(guān)。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)CD82可能是通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來抑制腎癌細胞的生長和侵襲。在本實驗中通過Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)過表達CD82加速了OSCC-25細胞的凋亡現(xiàn)象。而Schoenfeld等[18]發(fā)現(xiàn)CD82與細胞凋亡有關(guān),是因為其可以產(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物并且調(diào)控促凋亡cdc42通路。這也為我們后續(xù)研究CD82作用于口腔鱗狀細胞信號通路提供了線索和方向。

總之,本實驗研究提示過表達CD82對口腔癌細胞OSCC-25細胞增殖、細胞侵襲有抑制作用,并且促進口腔鱗癌細胞凋亡。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可能為口腔癌的靶向治療提供了一種新思想和新途徑。

參考文獻：

[1]Marcu LG, Yeoh E. A review of risk factors and genetic alterations in head and neck carcinogenesis and implications for current and future approaches to treatment[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(10):1303-1314.

[2]Parkin DM, Bray F, Ferlay J,etal. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74-108.

[3]Torre LA, Bray F, Siegel RL,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[4]Huang W, Yang J, Ren J,etal. Expression of PTEN and KAI1 tumor suppressor genes in pancreatic carcinoma and its association with different pathological factors[J]. Oncol Lett, 2016, 11(1):559-562.

[5]Ma ZB, Li K, Wang J,etal. Role of KAI1/CD82 polymorphisms in colon cancer risk in Han Chinese population[J]. Med Oncol, 2013, 30(3):668.

[6]Tang Y, Bhandaru M, Cheng Y,etal. The role of the metastasis suppressor gene KAI1 in melanoma angiogenesis[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2015, 28(6):696-706.

[7]Guo J, Fan KX, Xie LI,etal. Effect and prognostic significance of the KAI1 gene in human gastric carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015, 10(4):2035-2042.

[8]Chai J, Ju J, Zhang SW,etal. p12CDK2-AP1 interacts with CD82 to regulate the proliferation and survival of human oral squamous cell carcinoma cells[J]. Oncol Rep, 2016, 36(2):737-744.

[9]Toyo-oka K, Yashiro-Ohtani Y, Park CS,etal. Association of a tetraspanin CD9 with CD5 on the T cell surface: role of particular transmembrane domains in the association[J]. Int Immunol, 1999, 11(12):2043-2052.

[10]Lagaudrière-Gesbert C, Le NF, Lebel-Binay S,etal. Functional analysis of four tetraspans, CD9, CD53, CD81, and CD82, suggests a common role in costimulation, cell adhesion, and migration: only CD9 upregulates HB-EGF activity[J]. Cell Immunol, 1997, 182(2):105-112.

[11]Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaeffer CW,etal. KAI1, a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2[J]. Science, 1995, 268(5212): 884-886.

[12]Jee BK, Park KM, Surendran S,etal. KAI1/CD82 suppresses tumor invasion by MMP9 inactivation via TIMP1 up-regulation in the H1299 human lung carcinoma cell line[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(2):655-661.

[13]Yang X, Wei LL, Tang C,etal. Overexpression of KAI1 suppresses in vitro invasiveness and in vivo metastasis in breast cancer cells[J]. Cancer Res, 2001, 61(13): 5284-5288.

[14]Uzawa K, Ono K, Suzuki H,etal. High prevalence of decreased expression of KAI1 metastasis suppressor in human oral carcinogenesis[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(3): 828-835.

[15]Kawasaki G, Yoshitomi I, Yanamoto S,etal. Expression of thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase in primary oral squamous cell carcinoma and corresponding metastases in cervical lymph nodes: association with the metastasis suppressor CD82[J]. Anticancer Res, 2011, 31(10):3521-3526.

[16]Odintsova E, Sugiura T, Berditchevski F. Attenuation of EGF receptor signaling by a metastasis suppressor, the tetraspanin CD82/KAI-1[J]. Curr Biol, 2000, 10(16):1009-1012.

[17]Zhu J, Liang C, Hua Y,etal. The metastasis suppressor CD82/KAI1 regulates cell migration and invasion via inhibiting TGF-β 1/Smad signaling in renal cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017, 8(31): 51559-51568.

[18]Schoenfeld N, Bauer MK, Grimm S. The metastasis suppressor gene C33/CD82/KAI1 induces apoptosis through reactive oxygen intermediates[J]. FASEB J, 2004, 18(1):158-160.