韓俊麗,田紅燕,劉　亞,范粉靈

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,西安　710004;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院周?chē)芸?3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科;*通訊作者,E-mail:tianhhyy@mail.xjtu.edu.cn)

肺動(dòng)脈高壓發(fā)展過(guò)程中,肺血管阻力增高,右室后負(fù)荷增高,發(fā)生右室肥厚,繼而發(fā)生右心衰竭[1]。右室功能是影響肺動(dòng)脈高壓病人預(yù)后的重要的決定因素[2-4]。右心和左心的胚胎發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能不同,目前對(duì)右心系統(tǒng)的研究不夠透徹。5-HT是一種血管活性物質(zhì),肺動(dòng)脈高壓時(shí)血清中的5-HT升高,與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生關(guān)系密切[5]。5-HT對(duì)肺動(dòng)脈高壓時(shí)右心系統(tǒng)影響的分子機(jī)制尚不明確。以往研究表明TRPC通道和calcineurin/NFAT信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、心肌肥厚的發(fā)生關(guān)系密切[6-10]。本研究觀察了肺動(dòng)脈高壓大鼠右室的TRPC通道和calcineurin/NFAT信號(hào)通路表達(dá)改變,并觀察了5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯對(duì)右室TRPC通道和calcineurin/NFAT信號(hào)通路表達(dá)的影響,初步探索了肺動(dòng)脈高壓時(shí)右心的分子和信號(hào)通路改變。

1　材料和方法

1.1　主要試劑與儀器

野百合堿(美國(guó)Sigma公司),沙格雷酯(日本三菱株式會(huì)社),TRPC1抗體(以色列Alomone公司),TRPC6抗體(以色列Alomone公司),Calcineurin A抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),NFATc3抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Epitomics公司),HRP標(biāo)記的多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)。熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad公司,Bio-Rad iQ5),凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad公司,ChemiDocTM)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性4周齡SD大鼠18只,體質(zhì)量150-200 g(清潔級(jí),購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓組和沙格雷酯組,每組6只。干預(yù)方法如下:①對(duì)照組：每日腹腔注射生理鹽水1 ml，每日給予生理鹽水1 ml灌胃；②肺動(dòng)脈高壓組：每日腹腔注射野百合堿(50 mg/kg)，每日給予生理鹽水1 ml灌胃；③沙格雷酯組：每日腹腔注射野百合堿(50 mg/kg)，每日給予沙格雷酯灌胃(100 mg/kg)。干預(yù)4周時(shí)取右室組織。

1.3　RT-PCR檢測(cè)大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcinneurin A/NFATc3的mRNA表達(dá)

取右室組織約50 mg,Trizol提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)右室中TRPC1、TRPC6、calcinneurin A、NFATc3的表達(dá)。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。計(jì)算ΔΔCt=(Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參)-(Ct對(duì)照組-Ct對(duì)照組內(nèi)參)。再計(jì)算2-ΔΔCt分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4　Western blot檢測(cè)大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcinneurin A/NFATc3的蛋白表達(dá)

取右室組織約50 mg,提取蛋白,-80 ℃保存。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。將硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉1 h。加一抗(稀釋比:TRPC1 1 ∶200,TRPC6 1 ∶200,calcineurin A 1 ∶500,NFATc3 1 ∶100,GAPDH 1 ∶1 000)孵育過(guò)夜。TBST洗后加二抗(稀釋比:HRP標(biāo)記的多克隆抗體1 ∶5 000),室溫慢搖孵育1 h。TBST洗3次,TBS洗1次。用化學(xué)發(fā)光法放入凝膠成像系統(tǒng)成像。Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用方差分析進(jìn)行組間相互比較。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表采用GraphPad Prism 5制作。

2　結(jié)果

2.1　沙格雷酯對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3 mRNA表達(dá)的影響

大鼠腹腔注射野百合堿,建立肺動(dòng)脈高壓模型[11]。對(duì)大鼠右室心肌組織的TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3mRNA表達(dá)進(jìn)行分析,肺動(dòng)脈高壓組的TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3的mRNA表達(dá)較對(duì)照組增高(P<0.05,見(jiàn)圖1)。5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯干預(yù)4周,沙格雷酯組的TRPC6、calcineurin A、NFATc3 mRNA表達(dá)較肺動(dòng)脈高壓組降低(P<0.05，見(jiàn)圖1);沙格雷酯組的TRPC1 mRNA表達(dá)較肺動(dòng)脈高壓組降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明沙格雷酯可減弱肺動(dòng)脈高壓大鼠右室的TRPC6、calcineurin A、NFATc3的mRNA表達(dá)。

2.2　沙格雷酯對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3蛋白表達(dá)的影響

對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌組織的TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。肺動(dòng)脈高壓組的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表達(dá)較對(duì)照組增高(P<0.05,見(jiàn)圖2);沙格雷酯組的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表達(dá)較肺動(dòng)脈高壓組降低(P<0.05,見(jiàn)圖2)。以上結(jié)果說(shuō)明沙格雷酯可減弱肺動(dòng)脈高壓大鼠右室的TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表達(dá)。

3　討論

肺動(dòng)脈高壓可導(dǎo)致右室肥厚,最終導(dǎo)致右心衰竭。右心衰竭是肺動(dòng)脈高壓病人預(yù)后的重要決定因素[3,4]。接受治療后病情穩(wěn)定或病情改善的肺動(dòng)脈高壓病人,其心輸出量更好,右室重構(gòu)更輕,右室功能更好[12]。右室的后負(fù)荷過(guò)重可導(dǎo)致右室肥厚,但有研究表明僅后負(fù)荷過(guò)重還不足以導(dǎo)致右心衰竭,可能因?yàn)檠苤貥?gòu)釋放的介質(zhì)進(jìn)一步影響右室肥厚,導(dǎo)致右心衰竭[13-15]。因此,對(duì)肺動(dòng)脈高壓時(shí)右心衰竭的分子機(jī)制研究十分必要。5-HT是一種血管活性物質(zhì),肺動(dòng)脈高壓時(shí)血清中的5-HT升高,與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生關(guān)系密切[5]。以往對(duì)右心衰竭機(jī)制的研究多是以左心衰竭為模型,而左心和右心在結(jié)構(gòu)和功能上有較大區(qū)別[16,17]。本研究對(duì)動(dòng)脈高壓大鼠的右室組織進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明右室心肌中TRPC1、TRPC6通道表達(dá)和calcineurin A/NFATc3表達(dá)上調(diào),5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯可降低肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌中的TRPC1、TRPC6通道表達(dá)和calcineurin A/NFATc3表達(dá)。沙格雷酯干預(yù)后,TRPC1的mRNA表達(dá)下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與樣本量小有關(guān)。既往研究表明TRPC通道和calcineurin/NFAT通路與心肌肥厚、心肌重構(gòu)、肺動(dòng)脈高壓關(guān)系密切,但對(duì)右心的相關(guān)研究較少。TRPC通道活化導(dǎo)致鈣離子相關(guān)的信號(hào)通路活化,引起心肌肥厚和重構(gòu)[18]。過(guò)表達(dá)TRPC6的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)壓力負(fù)荷更敏感,表現(xiàn)為心臟肥厚和心肌收縮功能降低[19]。過(guò)表達(dá)TRPC3的轉(zhuǎn)基因小鼠的鈣庫(kù)操縱的鈣離子內(nèi)流(SOCE)增加,NFAT活性增加,并發(fā)展為心肌肥厚、心臟功能受損,calcineurin Aβ基因缺失可減弱TRPC3轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌肥厚[20]。TRPC1基因缺失小鼠在壓力負(fù)荷或神經(jīng)體液應(yīng)激條件下不表現(xiàn)心臟肥厚和心力衰竭[21]。主動(dòng)脈縮窄致左室肥厚的大鼠模型中,左室心肌TR-PC1表達(dá)增高[22]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)是異源二聚體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,參與多種細(xì)胞反應(yīng)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶包括催化亞單位(calcineurin A)和調(diào)節(jié)亞單位(calcineurin B)?；罨疶細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)通路控制心血管系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程中的許多步驟,有5個(gè)類(lèi)型,NFATc1-c5[9,10,23]。TRPC通道開(kāi)放和細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高可進(jìn)一步促進(jìn)calcineurin/NFAT信號(hào)通路活化,促進(jìn)細(xì)胞增殖、心肌肥厚[10,19,20,24]。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與肺動(dòng)脈高壓組比較,#P<0.05圖1　沙格雷酯對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3 mRNA表達(dá)的影響(n=6)Figure 1　The effect of sarpogrelate on the mRNA expression of TRPC1, TRPC6, calcineurin A and NFATc3 in the right ventricle of rats with pulmonary hypertension(n=6)

1.對(duì)照組；2.肺動(dòng)脈高壓組；3.沙格雷酯組；與對(duì)照組比較,*P<0.05;與肺動(dòng)脈高壓組比較,#P<0.05圖2　沙格雷酯對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3蛋白表達(dá)的影響(n=6)Figure 2　The effect of sarpogrelate on the protein expression of TRPC1, TRPC6, calcineurin A and NFATc3 in the right ventricle of rats with pulmonary hypertension(n=6)

綜上所述,TRPC通道和calcineurin/NFAT信號(hào)通路是心肌肥厚、心臟衰竭中重要的分子和信號(hào),本研究觀察到肺動(dòng)脈高壓大鼠的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A/NFATc3表達(dá)上調(diào),5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯可以抑制肺動(dòng)脈高壓大鼠右室的TRPC1、TRPC6、calcineurin A/NFATc3過(guò)表達(dá)。對(duì)于肺動(dòng)脈高壓時(shí)右心功能機(jī)制的深入研究有助于更深入理解肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制,尋找更好的治療靶點(diǎn)。

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