柴　娟,孫沫逸,劉昌奎,李海燕,劉　寧,黃　碩

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔系口腔頜面外科教研室,西安　710021;2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科;3西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系;*通訊作者,E-mail:chaijuan82@126.com)

頭頸癌是世界常見惡性腫瘤之一,它包括唇癌、口腔癌、鼻腔癌、鼻竇癌、咽喉癌等[1]。其中口腔癌的發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢[2]。CD82是TM4SF蛋白家族中的主要成員之一,最先是在Dunning家兔前列腺癌模型中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[3]。本團(tuán)隊(duì)前期工作觀察到,在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)CD82可以有效抑制口腔癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本次研究采用人口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型,觀察CD82對(duì)人口腔鱗癌裸鼠移植瘤生長的影響,為探討其在口腔鱗癌作用提供體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株和質(zhì)粒

5周齡雄性BALB/c裸鼠,體質(zhì)量18-22 g,購自北京維通利華公司,生產(chǎn)許可證SCXK(京)2012-0001,第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)。口腔鱗癌OSCC-15細(xì)胞購于美國菌種保藏中心ATCC,真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔頜面創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2　主要試劑及儀器

胎牛血清購自美國Sigma公司,DMEM培養(yǎng)基購自英國Oxoid,FBS購自美國Invitrogen公司,胰蛋白酶購自北京鼎國昌盛生物有限公司(27025-H-8),Ki67抗體(Dako,丹麥),PCNA抗體(Abcam,美國),鼠兔通用免疫組化二抗試劑盒(上?；蚩萍?。AE31型顯微鏡購自國產(chǎn)Motic。免疫組化試劑盒(KIT-5020)購自國產(chǎn)福州邁新生物公司。

1.3　口腔癌裸鼠移植瘤模型的建立

體外培養(yǎng)三組細(xì)胞,人口腔鱗癌OSCC-15細(xì)胞為空白對(duì)照組;轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體的OSCC-15細(xì)胞為陰性對(duì)照組;轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-CD82過表達(dá)載體的OSCC-15細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。將處于對(duì)數(shù)生長期的三組細(xì)胞各0.2 ml(1×106/ml)混懸液接種于裸鼠右前肢皮下,建立裸鼠移植瘤模型。每組接種6只,接種后第3天開始觀察瘤體大小,直至25 d后采用脫頸法處死裸鼠,并完整取出瘤體,稱其質(zhì)量。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑a(mm)和最短徑b(mm)。計(jì)算腫瘤體積(V=a×b2×0.52)、瘤體積抑制率=(V正常對(duì)照組-V實(shí)驗(yàn)組)/V正常對(duì)照組×100%。

1.4　免疫組化檢測Ki67及PCNA

常規(guī)石蠟移植瘤標(biāo)本,每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片30張(4 μm/張),脫蠟、水化處理后,1×PBS緩沖液洗滌,高壓修復(fù)抗原、1×PBS緩沖液洗滌再次清洗、3%過氧化氫滴加在組織切片、10%山羊血清封閉且甩去多余液體。再分別加入50 μl一抗稀釋度為1 ∶300的Ki67和1 ∶200的PCNA,置于濕盒內(nèi),4 ℃過夜,防止切片干燥。1×PBS緩沖液漂洗后,加復(fù)合二抗酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(Polymerized HRP-Anti Ms/RbIgG),3×PBS緩沖液漂洗后,DAB顯色,在顯微鏡下掌握染色程度約4 min。蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化。脫水、封片,光鏡觀察。結(jié)果判定:陽性表達(dá)為細(xì)胞核染成黃色或棕黃色(顯微鏡400倍下計(jì)數(shù),連續(xù)5個(gè)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù))。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

IPP 6.0軟件計(jì)數(shù)免疫組化的陽性細(xì)胞數(shù),采用SPSS19.0軟件(IBM SPSS,Armonk,NY,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)記錄,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　口腔癌細(xì)胞OSCC-25中CD82的高表達(dá)

在轉(zhuǎn)染后72 h CD82免疫熒光鏡下可以觀察到超過90%的OSCC-25細(xì)胞中有CD82的表達(dá)(見圖1)。

圖1　轉(zhuǎn)染后72 h口腔癌細(xì)胞OSCC-25中CD82的表達(dá)Figure 1　Expression of CD82 in OSCC-25 cells after transfection with CD82 for 72 h

2.2　CD82對(duì)移植瘤在裸鼠體內(nèi)生長的影響

細(xì)胞接種于裸鼠右前肢皮下第7天所有裸鼠觀察到米粒大的移植瘤,呈結(jié)節(jié)性生長,成瘤率為100%。接種后25 d完整后取出瘤體,實(shí)驗(yàn)過程中無一例裸鼠死亡。所取移植瘤形態(tài)見圖2。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組移植瘤體質(zhì)量分別為(0.87±0.21)g,(0.81±0.29)g,(0.44±0.37)g,陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤抑制率分別為(17.28±5.21)%,(77.21±3.25)%,實(shí)驗(yàn)組有效抑制了腫瘤增長,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖2　不同組別6只裸鼠移植瘤體積形態(tài)Figure 2　The xenograft shape of tumors from different groups

與空白組和陰性對(duì)照組比較,*P<0.05圖3　各組裸鼠移植瘤體積隨時(shí)間變化的生長曲線Figure 3　The growth curve of xenograft at different time points

2.3　CD82對(duì)裸鼠全身一般狀態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)期間,空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)食飲水、活動(dòng)正常,反應(yīng)敏捷,精神狀態(tài)均良好。用藥前各組裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組裸鼠體質(zhì)量亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見表1)。

2.4　裸鼠移植瘤內(nèi)Ki67的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,Ki67在各組移植瘤內(nèi)均有表達(dá)(見圖4)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組每視野分別為522.23±101.17,538.36±105.72,348.51±117.09個(gè)。實(shí)驗(yàn)組Ki67的表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組下降明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別n實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后空白組 618.75±2.5525.25±1.62陰性對(duì)照組618.76±2.7124.75±0.96實(shí)驗(yàn)組 618.87±2.6224.92±0.73

2.5　裸鼠移植瘤內(nèi)PCNA的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,PCNA在各組移植瘤內(nèi)均有表達(dá)(見圖5)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組每視野分別為542.12±201.25,558.33±205.22,288.18±136.05個(gè)。實(shí)驗(yàn)組PCNA的表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組下降有明顯差異(P<0.01)。

3　討論

CD82基因也被稱為KAI1基因、R2抗原、C33、IA4、4F9。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)并證實(shí),CD82與多種組織腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性[4-7]。裸鼠是在近十幾年中發(fā)展起來的動(dòng)物模型,因其先天性胸腺發(fā)育不良,而導(dǎo)致TB淋巴免疫細(xì)胞缺陷。另外它具有使移植瘤體容易成活的特點(diǎn),所以也常常成為目前腫瘤學(xué)和免疫學(xué)研究所需要的動(dòng)物模型之一。

圖4　各組裸鼠移植瘤Ki67免疫組化染色 (×400)Figure 4　The expression of Ki67 in xenograft by immunohistochemistry (×400)

圖5　各組裸鼠移植瘤PCNA免疫組化染色 (×400)Figure 5　The expression of PCNA in xenograft by immunohistochemistry (×400)

已有研究證實(shí),CD82基因在很多組織裸鼠移植瘤模型中有抑制作用。Liu等[8]將過表達(dá)CD82基因轉(zhuǎn)染于胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞系后,注射于裸鼠皮下。通過觀察裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長曲線及免疫組化切片,發(fā)現(xiàn)CD82能抑制胰腺癌腫瘤的生長及其腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。Tang等[6,9]通過體內(nèi)裸鼠模型實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)CD82能夠抑制人的黑色素瘤體內(nèi)血管的形成,而沉默CD82后瘤體內(nèi)血管有顯著增加。但國內(nèi)外尚無報(bào)道過表達(dá)CD82會(huì)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長有怎樣的影響。本實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞研究水平基礎(chǔ)上,通過將CD82基因轉(zhuǎn)染于口腔鱗癌細(xì)胞OSCC-15后注射于裸鼠皮下,觀察裸鼠瘤體的體積生長曲線及腫瘤抑制率。實(shí)驗(yàn)中與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn),CD82轉(zhuǎn)染組對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞裸鼠抑制瘤生長有明顯抑制作用。這與學(xué)者[6-9]關(guān)于CD82在其他組織的裸鼠移植瘤模型中作用的研究結(jié)果是相一致的。

本次實(shí)驗(yàn)期間,18只裸鼠模型均在注射后第7天觀察到開始成瘤,成瘤率為100%。動(dòng)物生長環(huán)境均為SPF級(jí)別,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,三組裸鼠動(dòng)物精神、飲食、活動(dòng)等方面均無明顯異常,體質(zhì)量持續(xù)增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明CD82對(duì)裸鼠無明顯的毒性作用。

Ki67抗原是近年來反映細(xì)胞增殖活性的蛋白標(biāo)記[10,11],與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān),在細(xì)胞增殖周期G1、S、G2、M期的細(xì)胞著色。國內(nèi)外很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)Ki67與口腔鱗狀細(xì)胞癌異常增生有關(guān)[12-15]。PCNA在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用,可用于評(píng)估腫瘤的惡性程度及增殖潛能。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCNA在口腔鱗癌中呈異常表達(dá)[16,17]。本研究結(jié)果顯示,CD82實(shí)驗(yàn)組與空白組、陰性對(duì)照組相比,Ki67、PCNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01),說明CD82具有明顯抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD82能夠抑制OSCC-15細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長,對(duì)裸鼠全身并無明顯毒性作用。其確切機(jī)制有待在以后的研究中進(jìn)一步探討,以期為CD82治療口腔鱗癌提供更多的理論依據(jù)。

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