高麗娟,李建國,趙　欣,徐　勇,楊　姣,張　宇*

(1山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系,太原　030001;2山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神科;4山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室;*通訊作者,E-mail:zhyucnm@163.com)

抑郁癥是情感性精神障礙綜合征,以顯著而持久的心境低落、認(rèn)知功能損傷、思維遲緩、意志活動減退等癥狀為主要臨床特征的一類心境障礙。隨著社會的飛速發(fā)展和生活節(jié)奏的加速,人們所承受的心理壓力越來越大,抑郁癥患病率也隨之呈逐年上升趨勢[1]。對抑郁癥的治療,氟西汀(fluoxetine)是最常用的抗抑郁藥之一[2],該藥通過提高血清中5-羥色胺的濃度促進(jìn)海馬神經(jīng)元的增殖和存活達(dá)到治療效果。然而該藥副作用比較多,對該藥治療效果的評價(jià)多通過臨床表現(xiàn)和量表等方式為依據(jù)[3],這些方法不僅周期較長而且可信度存在差異,因此有必要嘗試周期短、省時(shí)省力、定位準(zhǔn)確的新方法。

基因芯片是一種基于高通量測序的方法,從基因水平對疾病進(jìn)行深度分析和研究。本文通過利用GEO公共數(shù)據(jù)庫中的資源,首次對長期服用氟西汀抑郁小鼠海馬部位的基因表達(dá)情況進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,從基因水平揭示抗抑郁藥的影響,為抑郁癥個(gè)體的用藥合理性及用藥指導(dǎo)提供了有力證據(jù)。

1　材料和方法

1.1　主要材料

美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus:https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo/)是當(dāng)前規(guī)模最大、收錄最全、免費(fèi)開放的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,本文以此為數(shù)據(jù)源,設(shè)定“fluoxetine”為關(guān)鍵檢詞,獲得GSE6476系列數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)中包括2個(gè)對照組和2個(gè)給藥組,對照組登錄號為GSM148900、GSM148901,給藥組登錄號為GSM148902、GSM148903。對照組為DBA/2J雄性抑郁小鼠,給藥組為DBA/2J雄性抑郁小鼠治療組,該組小鼠通過主動飲用加有氟西汀藥物的水,從而得到治療,并結(jié)合懸尾試驗(yàn)對抑郁效果進(jìn)行驗(yàn)證,取小鼠海馬組織進(jìn)行測序,本文對該芯片測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。

1.2　樣本分析的主要方法

本文數(shù)據(jù)分析和作圖主要采用R語言與Bioconductor以及網(wǎng)絡(luò)分析軟件。其中,R語言是一種用來進(jìn)行數(shù)據(jù)探索、統(tǒng)計(jì)分析和作圖的解釋型語言,在統(tǒng)計(jì)分析、生物學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

1.3　樣本的主成分分析

主成分分析(PCA)可將一個(gè)多變量的復(fù)雜問題簡化為低維空間的簡單問題。本文使用R語言自帶函數(shù)“prcomp”對差異基因進(jìn)行主成分分析,從而使復(fù)雜數(shù)據(jù)簡單化,方便進(jìn)一步分析。

1.4　差異基因的篩選

Bioconductor是基于R語言開發(fā)的面向基因組生物信息分析的應(yīng)用軟件集合,它提供的各種基因組數(shù)據(jù)分析和注釋工具主要針對DNA微陣列或基因芯片數(shù)據(jù)的處理、分析、注釋及可視化。本文采用R語言與Bioconductor中“l(fā)imma”包篩選差異基因,設(shè)定logFC>1,P<0.05為條件,并用聚類圖和火山圖展示結(jié)果。

1.5　差異基因的GO功能富集分析

采用The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID)在線基因注釋軟件(https://david.ncifcrf.gov/)選取Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行功能富集分析,從生物過程(biological process,BP),細(xì)胞組成(cellular component, CC),分子功能(molecular function, MF)三個(gè)方面對基因涉及的功能進(jìn)行注釋、富集和聚類,定位差異基因最可能涉及到的過程,從而分析差異基因所涉及的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成以及分子功能方面上的差異和變化。

1.6　差異基因的Pathway生物學(xué)通路分析

本研究采用KEGG在線軟件(http://www.kegg.jp/)對差異基因進(jìn)行Pathway通路分析。在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,基于Pathway的分析有助于更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。

1.7　差異基因所編碼蛋白之間相互作用分析

STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一個(gè)常用來驗(yàn)證已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的軟件系統(tǒng),本研究采用STRING在線數(shù)據(jù)庫繪制靶基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,預(yù)測涉及抑郁癥用藥相關(guān)的核心基因。并結(jié)合Universal Protein Resource(Uniprot)網(wǎng)站查詢基因的功能和作用。

2　結(jié)果

2.1　樣本的主成分分析結(jié)果

本研究采用R語言自帶函數(shù)包“prcomp”對差異基因進(jìn)行主成分分析,使高通量數(shù)據(jù)降維成為簡化的數(shù)據(jù),取貢獻(xiàn)率最大的前三個(gè)主成分PCA1,PCA2,PCA3進(jìn)一步分析,可以看出樣品間互不相干(見圖1),有利于提取兩類樣品的特征信息進(jìn)行下一步分析。

2.2　差異基因的篩選結(jié)果

通過R語言和Bioconductor的分析,獲得144個(gè)差異基因,其中上調(diào)基因111個(gè),下調(diào)基因33個(gè)(見圖2,3)。選取前50個(gè)差異基因構(gòu)建分層聚類圖,圖中的4個(gè)列表示樣本,其中前兩列代表對照組,后兩列代表給藥組,各行表示差異基因的表達(dá)情況(見圖3)。

con為對照組;sam為給藥組;PC1、PC2、PC3分別表示3個(gè)主成分圖1　差異基因的主成分分析圖Figure 1　Principal component analysis of differentially expressed genes

紅點(diǎn)表示上調(diào)基因,綠點(diǎn)表示下調(diào)基因;adj.P.Val是矯正后的P值圖2　差異基因的火山圖Figure 2　Volcano plot of the differentially expressed genes

圖3　差異基因的分層聚類圖Figure 3　Hierachical clustering of the differentially expressed genes

2.3　差異基因的GO功能富集分析結(jié)果

通過DAVID在線軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)差異基因主要分布在胞外區(qū)(GO:0005576)、胞外空隙(GO:0005615)、細(xì)胞外基質(zhì)(GO:0031012)、基膜(GO:0005604)、細(xì)胞表面(GO:0009986)、女性妊娠(GO:0007565)、樹突(GO:0030425)、膠原原纖維組織(GO:0030199)、鈣離子結(jié)合(GO:0005509)、神經(jīng)肽信號通路(GO:0007218)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(GO:0048471)、細(xì)胞因子應(yīng)答(GO:0034097)等過程(見表1)。另外,GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因(P<0.005)參與生物過程有14個(gè),參與細(xì)胞成分有16個(gè),參與分子功能有9個(gè)(見圖4)。

參與生物過程(綠色部分),細(xì)胞成分(藍(lán)色部分),分子功能(紫色部分)(P<0.005)圖4　GO功能富集分析差異基因Figure 4　The result of gene ontology(GO) function analysis of differentially expressed genes

2.4　差異基因的Pathway生物學(xué)通路分析結(jié)果

通過R語言與Bioconductor的“stringi”包獲得8個(gè)Pathway通路(見圖5),經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要集中在甘油酯代謝、N-聚糖的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝途徑、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、氧化磷酸化等通路中。

2.5　差異基因所編碼蛋白的相互作用結(jié)果

經(jīng)STRING在線軟件分析篩選出78個(gè)差異表達(dá)基因所編碼的蛋白產(chǎn)物存在相互作用(見圖6,7)。圖6和圖7為前30個(gè)差異表達(dá)基因構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò),并篩選到Vim、Bdnf、Npy、Gfap、Penk、Fosb、Cd44、Timp1、Lgals1等核心基因(logFC>1,節(jié)點(diǎn)數(shù)>5)。

表1差異基因GO功能富集分析,包括生物過程,細(xì)胞成分,分子功能

Table1Geneontology(GO)Functionanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinvolvedinbiologicalprocess,cellularcomponentandmolecularfunction

分類GO術(shù)語 描述富集基因數(shù)P生物過程GO:0007565女性妊娠70.00003生物過程GO:0010628正調(diào)控基因表達(dá)120.00016生物過程GO:0030199膠原原纖維組織50.00018生物過程GO:0007218神經(jīng)肽信號通路60.00023生物過程GO:0034097細(xì)胞因子應(yīng)答60.00031生物過程GO:0045185蛋白定位的維持30.00031生物過程GO:0007155細(xì)胞粘附120.00081生物過程GO:0042493藥物應(yīng)答100.00082生物過程GO:0007268化學(xué)突觸傳遞70.00159生物過程GO:0007568老化70.00164生物過程GO:0007631攝食行為40.00189生物過程GO:0001662恐懼反應(yīng)40.00347生物過程GO:0021675神經(jīng)發(fā)育30.00386生物過程GO:0042060傷口愈合50.00485細(xì)胞成分GO:0005576胞外區(qū)430細(xì)胞成分GO:0005615胞外空隙340細(xì)胞成分GO:0005578細(xì)胞外基質(zhì)蛋白160細(xì)胞成分GO:0031012細(xì)胞外基質(zhì)150細(xì)胞成分GO:0005604基膜80細(xì)胞成分GO:0009986細(xì)胞表面170細(xì)胞成分GO:0070062外泌體360細(xì)胞成分GO:0030425樹突130.00013細(xì)胞成分GO:0048471細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)150.00025細(xì)胞成分GO:0043025神經(jīng)元胞體120.00102細(xì)胞成分GO:0005886質(zhì)膜500.00129細(xì)胞成分GO:0009897質(zhì)膜外側(cè)90.00143細(xì)胞成分GO:0072562血液微粒60.00211細(xì)胞成分GO:0016323質(zhì)膜基底外側(cè)70.00260細(xì)胞成分GO:0030424軸突90.00372細(xì)胞成分GO:0005887質(zhì)膜整體170.00391分子功能GO:0005509鈣離子結(jié)合160.00022分子功能GO:0005515蛋白結(jié)合490.00037分子功能GO:0043236層粘連蛋白結(jié)合40.00093分子功能GO:0005102受體結(jié)合110.00104分子功能GO:0001968纖連蛋白結(jié)合40.00128分子功能GO:0005184神經(jīng)肽活性40.00128分子功能GO:0048306鈣依賴蛋白結(jié)合50.00175分子功能GO:0019838生長因子結(jié)合40.00375分子功能GO:0008083生長因子活性60.00462

從紅色到藍(lán)色,顏色越藍(lán),表示富集程度越高,橫軸代表富集基因數(shù),縱坐標(biāo)代表通路術(shù)語圖5　差異基因的Pathway通路分析Figure 5　Pathway analysis of differentially expressed genes

3　討論

本研究經(jīng)過R語言與Bioconductor處理數(shù)據(jù),結(jié)合DAVID、STRING、Uniprot等生物信息學(xué)方法對長期服用氟西汀的抑郁小鼠海馬基因表達(dá)情況進(jìn)行了深入分析,從基因水平揭示長期服用抗抑郁藥對機(jī)體的影響,最后得到Vim[4]、Bdnf[5]、Npy、Gfap[6]、Penk、Fosb[7]、Cd44[8]、Timp1、Lgals1等核心基因,這些基因在神經(jīng)肽通路、女性生育、突觸傳遞、神經(jīng)發(fā)育等過程中扮演了重要的角色。其中,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,Bdnf)與抑郁癥之間的關(guān)系已有比較多的研究,Bdnf在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中對神經(jīng)元的存活、分化和生長發(fā)育起著重要的作用,能改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、增加突觸可塑性、促使受傷的神經(jīng)元再生和修復(fù)[9],從而使抑郁癥達(dá)到一定的治療效果。Taliaz等[10]曾利用慢病毒載體和RNA干擾技術(shù)直接作用于海馬區(qū),使齒狀回中Bdnf表達(dá)量下降,減少了海馬體神經(jīng)元分化,影響抑郁行為,從而證明Bdnf和抑郁癥的發(fā)生機(jī)制有直接關(guān)系,本文結(jié)論與此一致。

圖6　差異基因表達(dá)蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖(節(jié)點(diǎn)數(shù)>5)Figure 6　Differentially expressed genes in the protein interactive network (count>5)

圖7　78個(gè)差異基因的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 7　Protein interaction network of 78 differentially expressed genes

本文篩選到的核心基因不僅是抑郁癥治療的相關(guān)基因,同時(shí)與疼痛[11]、炎癥[12]、認(rèn)知[13]、癲癇、精神分裂癥[14]等疾病也有密切聯(lián)系。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道,這些疾病大都是抑郁癥的共患病,并且本文篩選到的核心基因在以上病癥中也有作用,比如Penk、Npy等基因在疼痛反應(yīng)中有重要的作用,其中,腦啡肽原(proenkephalin-A,Penk)是神經(jīng)遞質(zhì)的一種,被稱作“腦內(nèi)嗎啡”,能夠模擬阿片藥物的作用在神經(jīng)系統(tǒng)中執(zhí)行重要的生理功能,其Penk(114-133)片段和Penk(237-258)片段能夠促進(jìn)紋狀體谷氨酸的釋放,從而對疼痛進(jìn)行調(diào)節(jié);而神經(jīng)肽Y(pro-neuropeptide Y,Npy)對突觸前神經(jīng)末端的谷氨酸釋放也有調(diào)節(jié)作用[15],從而對疼痛有一定的作用。另外,Li等[11]通過對外側(cè)韁核處的放電頻率及c-Fos表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)抑郁和疼痛總是相伴發(fā)生的,并證明抑郁癥和疼痛的發(fā)病機(jī)制之間有著密切的聯(lián)系,可見疼痛和抑郁的共患關(guān)系。

然而,抑郁癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,一般認(rèn)為與遺傳、性別、神經(jīng)內(nèi)分泌[16]、免疫[17]、心理社會環(huán)境[18]以及腸道微生物[19]等因素有關(guān)。近幾年,單胺類遞質(zhì)假說被科研人員普遍認(rèn)可,該理論認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生主要是由突觸間單胺類遞質(zhì)(如5-羥色胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等)異常引起的,有文獻(xiàn)報(bào)道,本文篩選到的關(guān)鍵基因Vim基因可與5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體C端結(jié)合,進(jìn)而影響5-TH含量[20],為氟西汀治療抑郁癥增加了理論后盾。另外,炎性免疫假說也越來越受到重視,該假說認(rèn)為抑郁癥是一種心理-神經(jīng)-免疫紊亂性疾病,免疫功能在抑郁癥的治療中起到了比較重要的作用[21]。林文娟等[22]采用中樞炎性免疫應(yīng)答造模,補(bǔ)充外源性成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)調(diào)節(jié)和提高細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號分子的水平的方法,改善了炎性免疫導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)生抑制,逆轉(zhuǎn)了中樞炎性免疫所引起的抑郁樣行為,這一研究為抑郁癥的發(fā)生機(jī)制增添了新的理論依據(jù)。除此之外,還有學(xué)者提出腸道微生物與抑郁癥的關(guān)系,該理論認(rèn)為長期處于壓力狀態(tài)下而抑郁的小鼠,其腸道微生物的組成和代謝特征也會發(fā)生顯著變化[23]。另外,藥物在機(jī)體內(nèi)的代謝也會影響腸道微生物的功能,藥物在機(jī)體內(nèi)不僅會誘導(dǎo)肝損傷,膽汁中排泄的藥物代謝物還會被腸道細(xì)菌重新變成藥物并被腸道再次吸收,即“增強(qiáng)型腸肝循環(huán)”的過程,與此同時(shí),腸道菌群發(fā)生特定的豐度變化[24],進(jìn)而影響疾病的發(fā)生,這是一條非常重要但是經(jīng)常被忽視的途徑,對該過程的發(fā)現(xiàn)和了解將有助于開發(fā)新的治療策略。也有研究人員認(rèn)為,腸道微生物對神經(jīng)系統(tǒng)的作用是以免疫系統(tǒng)為重要調(diào)節(jié)者來協(xié)調(diào)中樞神經(jīng)生理功能和行為方面的相互作用[25],進(jìn)而推測中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腸道微生物之間的密切關(guān)系。

綜上所述,影響抑郁行為的機(jī)制和原因錯(cuò)綜復(fù)雜,本文篩選到的核心基因有可能作為治療抑郁癥、評估治療效果以及預(yù)測抗抑郁癥藥物副作用的潛在靶點(diǎn)基因,本文分析結(jié)果也為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了重要的線索和參考信息。

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