任海強,閆　莉,李　月,景　赫,金　沐,程衛(wèi)平,盧家凱*

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院,北京市心肺血管疾病研究所麻醉科,北京　100029;2清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院麻醉科;3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理生理學(xué)系;*通訊作者,E-mail:lujiakai620@163.com)

炎癥反應(yīng)是各類圍手術(shù)期創(chuàng)傷的重要病理生理變化[1,2]。研究表明,患者術(shù)前的焦慮、營養(yǎng)不良、饑餓等,術(shù)中的手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉、輸血、低體溫等,以及術(shù)后疼痛、缺血、感染、胃腸功能障礙等因素[3-5]可通過不同途徑激活炎癥細(xì)胞,引起局部炎癥反應(yīng),參與機體防御反應(yīng)[6]。如果大量炎癥細(xì)胞被活化,則會引發(fā)過度炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致重要器官功能障礙[7]。

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑(α2-AR),具有中樞性抗交感和抗焦慮作用[8],是臨床常用麻醉藥之一。臨床和基礎(chǔ)研究已證實,DEX具有良好的抗炎效果[9,10],可能有利于抑制圍手術(shù)期過度的炎癥反應(yīng),改善患者的預(yù)后。鑒于巨噬細(xì)胞的遷移功能是實現(xiàn)其參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),本實驗擬利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥反應(yīng)模型,在此基礎(chǔ)上觀察不同濃度的DEX對巨噬細(xì)胞遷移功能的影響,并初步探討其參與抗炎作用的可能作用途徑。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

鹽酸右美托咪定,育亨賓,脂多糖(美國sigma公司),抗α2腎上腺素受體一抗(美國abcam公司),FITC熒光標(biāo)記羊抗兔IgG(美國Abcam公司),DAPI染料(美國Invitrogen公司),Transwell(Corning公司),檢測TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒(美國R&D公司),RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系、胎牛血清、青霉素、鏈霉素以及高糖DMEM(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心),PVDF膜(美國millipore公司)。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)及處理

使用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系,并置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中生長。細(xì)胞生長至70%-80%融合時,給予實驗處理用于檢測巨噬細(xì)胞遷移能力,分組如下:對照組,未加LPS處理;LPS組,在培養(yǎng)基中加入LPS(10 μg/ml);LPS+低劑量DEX組;LPS+中劑量DEX組;LPS+高劑量DEX組。后三組分別在LPS(10 μg/ml)處理的基礎(chǔ)上給予0.01,0.1,1.0 μmol/L的DEX處理。為進一步觀察DEX影響細(xì)胞的遷移功能是否通過激活α2腎上腺素受體(α2-AR)發(fā)揮作用,本實驗在LPS(10 μg/ml)處理的基礎(chǔ)上給予0.1 μmol/L的DEX和10 μmol/L的育亨賓處理(LPS+DEX+YOH組),檢測其細(xì)胞遷移能力和巨噬細(xì)胞中PKCζ蛋白水平的表達。

1.3　ELISA法檢測細(xì)胞因子

實驗結(jié)束后留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,保存于-80 ℃,采用ELISA法檢測上清液中TNF-α和IL-6的濃度,具體步驟根據(jù)試劑盒說明書操作。

1.4　Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力

向Transwell下室中加入含趨化因子的無血清培養(yǎng)基,每孔600 μl。用0.25%胰酶消化RAW264.7細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml,在Transwell上室內(nèi)小心加入100 μl細(xì)胞懸液,避免產(chǎn)生氣泡,使細(xì)胞均勻布滿,將Transwell置于培養(yǎng)箱24 h。將Transwell小室取出后用濕棉簽擦凈小室上表面細(xì)胞,自然風(fēng)干,于0.1%結(jié)晶紫中浸泡30 min,再用PBS漂凈。使用顯微鏡先照相記錄,后期使用Image Pro軟件對結(jié)晶紫染色細(xì)胞進行計數(shù),結(jié)果以實驗組細(xì)胞遷移的數(shù)量為對照組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量的倍數(shù)表示。

1.5　免疫細(xì)胞熒光法檢測α2-AR的表達

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞傳代至直徑為1 cm的無菌圓玻片,待細(xì)胞貼壁后用4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBS清洗3次,0.1% Triton X-100破膜10 min,PBS清洗3次。隨后使用2% BSA封閉液封閉30 min,吸走封閉液并滴加兔抗小鼠α2-AR一抗,4 ℃條件下置于濕盒中過夜。次日加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗,室溫下孵育45 min,PBS漂洗,加入0.5 μg/ml的DAPI染色10 min,PBS漂洗3次,取出蓋玻片置于載玻片上并使用防熒光淬滅封片劑封片后,在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照。

1.6　Western blotting檢測PKCζ的表達

將細(xì)胞使用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解,并用BCA法檢測樣品中蛋白含量。用SDS-PAGE分離蛋白,上樣量為30 μg總蛋白/泳道,之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后,4 ℃孵育一抗(anti-PKCζ和anti-GAPDH)過夜。一抗孵育完畢,以TBST充分清洗,之后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1 ∶500)。免疫復(fù)合物以化學(xué)發(fā)光的方法檢測,蛋白免疫印跡條帶使用Image J圖像分析軟件進行光密度定量,用GAPDH做上樣量參照。

1.7　統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　DEX可以顯著降低巨噬細(xì)胞促炎因子的釋放

本實驗利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥反應(yīng)模型,結(jié)果表明,與對照組相比,LPS組RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6的釋放可以明顯增加(P<0.01,見圖1)。給予DEX(0.01,0.1,1.0 μmol/L)處理后,可以濃度依賴性地降低TNF-α和IL-6的水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與對照組相比,**P<0.01;與LPS組相比,#P<0.05,##P<0.01圖1　DEX能夠濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放　　Figure 1　Inhibitory effect of dexmedetomidine on the release of inflammatory cytokines from LPS-stimulatedRAW264.7 in a dose-dependent manner

2.2　DEX可以濃度依賴性抑制巨噬細(xì)胞的遷移

Transwell結(jié)果顯示，LPS組的RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量為對照組的(14.24±0.85)倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2);而0.01,0.1,1.0 μmol/L的DEX則明顯減少了巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量,分別為對照組的(11.19±1.33)倍、(4.34±0.68)倍和(2.56±0.69)倍,呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,與LPS組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　不同濃度DEX對RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移功能的影響 (×200)Figure 2　Effect of different doses of dexmedetomidine on the migration of LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells (×200)

2.3　DEX通過作用于α2-AR影響巨噬細(xì)胞的遷移能力

鑒于DEX是高選擇性的α2-AR特異性激動劑,為了進一步探討DEX抑制巨噬細(xì)胞遷移功能的作用是否通過激動α2-AR來介導(dǎo)的,本研究首先對RAW264.7巨噬細(xì)胞上是否具有α2-AR的表達進行驗證。實驗結(jié)果表明,RAW264.7巨噬細(xì)胞表面α2-AR的表達呈陽性(細(xì)胞膜和部分胞質(zhì)呈綠色熒光),DAPI染色的細(xì)胞核呈藍色熒光(見圖3)。

為了進一步探討DEX是否通過激動α2-AR發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞遷移的作用,本實驗使用α2-AR特異性的阻斷劑育亨賓(10 μmol/L)對巨噬細(xì)胞進行預(yù)處理。結(jié)果表明,與0.1 μmol/L的DEX組相比,10 μmol/L育亨賓處理后可以明顯增加巨噬細(xì)胞的遷移數(shù)量(9.34±1.56vs4.34±0.68,P<0.05,見圖4)。

Green:α2-AR; blue: nuclear圖3　RAW264.7巨噬細(xì)胞中α2-AR的表達 (×200)Figure 3　The expression of α2-AR in RAW264.7 macrophage cells examined by immunoflurence staining (×200)

圖4　育亨賓可以明顯逆轉(zhuǎn)DEX對RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移能力的抑制作用 (×200)Figure 4　The inhibitory effect of dexmedetomidine on RAW264.7 macrophage cell was reversed by selective α2-AR block yohimbine (×200)

2.4　0.1 μmol/L DEX抑制巨噬細(xì)胞PKCζ的表達

Western blot實驗結(jié)果表明,與LPS處理組相比,DEX可以明顯下調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞中PKCζ的表達,而使用10 μmol/L育亨賓處理后,可以明顯逆轉(zhuǎn)PKCζ的表達(見圖5)。

3　討論

DEX是一種高選擇性的、高效的α2-AR激動劑,具有中樞性抗交感、抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用[7],同時對重要器官具有一定的保護功能[11,12]。目前,越來越多的臨床和基礎(chǔ)研究表明DEX具有良好的抗炎作用[9,10]。Kang等[9]開展的臨床研究證實,DEX可顯著降低接受腹腔鏡膽囊切除手術(shù)患者術(shù)中和術(shù)后1 h血清中促炎細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-4)的水平?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),DEX干預(yù)組能顯著降低膿毒癥小鼠血清中TNFα和IL-6水平,同時抑制血清高遷移率族蛋白B1和肺高遷移率族蛋白B1 mRNA的表達水平[13]。本研究利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥反應(yīng)模型,觀察到DEX可以濃度依賴性地減輕巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α和IL-6,這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果[9,13]一致。

單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)參與機體固有免疫、介導(dǎo)和促進炎癥反應(yīng)、實施免疫殺傷功能以及抗原加工和提呈[14]。炎癥部位高濃度趨化因子MCP-1、IFN-γ等可與單核/巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體作用,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化并向感染部位遷移。活化的單核/巨噬細(xì)胞進一步分泌巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-1α/β、MCP-1和IL-8等趨化因子,誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化和募集,誘導(dǎo)和加強局部的炎癥反應(yīng);活化的巨噬細(xì)胞分泌的因子能調(diào)動其他粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,共同促進局部及全身的炎癥反應(yīng)。由此可見,在參與機體炎癥反應(yīng)的過程中,巨噬細(xì)胞的遷移功能是實現(xiàn)其參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究首次從巨噬細(xì)胞遷移功能的角度探討DEX對炎癥反應(yīng)的保護作用。臨床麻醉鎮(zhèn)靜中,DEX的推薦使用劑量相當(dāng)于血漿中濃度為0.01-0.1 μmol/L[15]。因此,本研究中選用0.01,0.1 μmol/L和1 μmol/L的DEX對巨噬細(xì)胞遷移功能的影響。結(jié)果表明,DEX在LPS刺激后可以濃度依賴性地抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的遷移功能,該作用均可被α2-AR抑制劑育亨賓所阻斷,提示DEX抑制巨噬細(xì)胞遷移可能是其發(fā)揮抗炎作用的機制之一。

與LPS組相比,**P<0.01;與LPS+DEX組相比,#P<0.05圖5　0.1 μmol/L DEX通過激活α2-AR明顯下調(diào)RAW264.7細(xì)胞遷移相關(guān)的PKCζ的表達Figure 5　The 0.1 μmol/L DEX significantly downregulated PKCζ expression in RAW264.7 macrophage cell via α2-AR

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一類使底物蛋白分子內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化的蛋白激酶家族,共有12種亞型,為細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)分子。其中,蛋白激酶Cζ是非典型PKC家族成員,廣泛參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，在許多胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化中都發(fā)揮了作用,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長及凋亡[16]。此外,PKCζ還參與了細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞的極化、分化、運動和腫瘤轉(zhuǎn)移等[17]。Zhang等[18]的研究表明,在CSF-1誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞趨化作用中,磷酸化Akt2激活下游的PKCζ,PKCζ進而激活LIMK/cofilin通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨架重構(gòu)從而促進細(xì)胞的趨化運動。因此,PKCζ是G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體所誘導(dǎo)的信號通路中一個共用的信號分子,同時也是細(xì)胞趨化運動途徑中的關(guān)鍵分子。本研究觀察到在LPS刺激后,DEX抑制巨噬細(xì)胞遷移功能,伴隨著PKCζ的表達量下調(diào),而α2-AR抑制劑育亨賓則可以逆轉(zhuǎn)PKCζ的表達,提示PKCζ是DEX抑制巨噬細(xì)胞遷移的下游作用位點。

綜上所述,本研究首次從炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞遷移功能的角度驗證DEX可以通過激活α2-AR,下調(diào)PKCζ的表達從而發(fā)揮其抗炎作用,提示DEX發(fā)揮抗炎作用可能通過下調(diào)PKCζ進而改變下游細(xì)胞骨架蛋白的活化,從而調(diào)控巨噬細(xì)胞的遷移功能。

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