鄭常龍， 符永玫， 詹浩洪， 陳天天， 鄒 勇， 梁彩倩△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1急診科, 2輸血科, 廣東 廣州 510630)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種肺血管阻力進(jìn)行性升高，持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致右心肥厚和右心衰竭甚至死亡的嚴(yán)重心血管疾病[1]。盡管近年來(lái)用于治療PAH的“靶向”藥物，如磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑等，雖能改善部分PAH患者的癥狀，但其不能明顯改善PAH患者預(yù)后[2]。右心重構(gòu)和右心衰竭是PAH患者死亡的主要原因。因此，積極探索PAH患者并發(fā)右心重構(gòu)和右心衰竭的發(fā)病機(jī)制并早期進(jìn)行干預(yù)，對(duì)PAH患者的預(yù)后至關(guān)重要。

多種微小RNA(microRNA，miRNA，miR)參與了PAH的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。有研究表明miR-124在肺動(dòng)脈高壓患者的肺血管平滑肌細(xì)胞和慢性缺氧誘導(dǎo)的PAH小鼠肺組織中均顯著下調(diào)，而且miR-124對(duì)肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用[5]，這提示miR-124在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。那么，過(guò)表達(dá)miR-124能否通過(guò)抑制肺血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖而降低肺動(dòng)脈壓力，進(jìn)而緩解右心重構(gòu)和右心衰竭呢？國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬采用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體介導(dǎo)miR-124過(guò)表達(dá)的方法，觀察其對(duì)野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右心重構(gòu)的作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為肺動(dòng)脈高壓右心重構(gòu)患者的治療提供參考資料和新的思路，為肺動(dòng)脈高壓的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

32只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g)采購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于該中心SPF級(jí)動(dòng)物房中。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度恒定(22±2)℃，濕度恒定(55±5)%，每天人工光照明暗各12 h，24 h自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)得到中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)為：IACUC-DB-16-1113)。

載體pHBAAV-U6-ZsGreen購(gòu)自上海漢恒生物有限公司；大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自Invitrogen；野百合堿購(gòu)自Sigma；SYBR Green qPCR SuperMix購(gòu)自Invitrogen；p-Samd2、Samd2和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗體購(gòu)自Abcam；多導(dǎo)生理記錄儀(MP150型)購(gòu)自BIOPAC；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自ABI。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1重組腺相關(guān)病毒的包裝和滴度測(cè)定 從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)獲得miR-124-3前體序列(5′-TGAGGGCCCCTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGC-ACGCGGTGAATGCCAAGAGAGGCGCCTCC-3′)，參考Luo等[6]的方法，構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序正確后克隆至pHBAAV-U6-ZsGreen質(zhì)粒的HpaI及XhoI位點(diǎn)，產(chǎn)生AAV-miR-124重組體。重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，大量包裝復(fù)制AAV-miR-124，以空白質(zhì)粒AAV-GFP作對(duì)照，經(jīng)純化后檢測(cè)滴度。AAV-miR-124 和 AAV-GFP的滴度分別為1.4×1015vg/L和2.0×1015vg/L (vg=viral genomes)。

2.2動(dòng)物模型的建立與分組 所有大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照(control，n=8)組、野百合堿(MCT+NS，n=8)組、野百合堿+AAV-GFP(MCT+GFP，n=8)組和野百合堿+AAV-miR-124(MCT+miR-124，n=8)組，其中MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后固定于傾斜60°的大鼠操作臺(tái)，插入自制的氣管導(dǎo)管套管，使用微量注射器經(jīng)氣管導(dǎo)管分別緩慢注入100 μL生理鹽水、AAV-GFP和AAV-miR-124。3周后，MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠一次性經(jīng)腹腔注射野百合堿(60 mg/kg)建立PAH右心重構(gòu)模型，飼養(yǎng)5周后達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

2.3右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure, RVSP)和平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure, MAP)的測(cè)定 根據(jù)鄒麗珍等[7]的方法測(cè)量大鼠RVSP和MAP。簡(jiǎn)要步驟為：用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，固定后暴露頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，顯微剪在頸外靜脈近心端剪開(kāi)約1/3，插入已預(yù)充盈肝素鈉鹽水(1×105U/L)的PE-100聚乙烯管，聚乙烯管通過(guò)換能器連接MP150多導(dǎo)生理記錄儀，記錄RVSP。穩(wěn)定10 min后保存數(shù)據(jù)，退出導(dǎo)管。分離出頸總動(dòng)脈，插入PE-50聚乙烯管，固定待波形穩(wěn)定后記錄動(dòng)脈波形，測(cè)定大鼠平均體循環(huán)動(dòng)脈壓mSAP。

2.4右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)和右心室重量指數(shù)(right ventricular weight index, RVWI)的測(cè)定 脫臼法處死大鼠后分離出心臟，洗凈血液，于4 ℃ PBS中剪除心房，沿室間溝分離出右心室(RV)和左室加室間隔(LV+S)兩部分，用濾紙吸干表面的水分，分別稱重后計(jì)算二者的比值即為RVHI，即RVHI=RV/(LV+S)。計(jì)算右心室(RV)重量與大鼠體重(BW)的比值即為RVWI，即RVWI=RV/BW。

2.5大鼠右心天狼星紅染色 右心組織塊經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后切片，行天狼星紅染色。染色步驟為：石蠟切片經(jīng)60℃烤箱中烤片2 h后，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，入天青石藍(lán)液8～10 min，蒸餾水輕輕沖洗4～6 min，再入天狼星紅飽和苦味酸染液染20～30 min。直接用無(wú)水乙醇快速分化和脫水，經(jīng)二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片。使用倒置顯微鏡觀察右心組織心肌細(xì)胞的病理學(xué)改變，高倍鏡(×400)下隨機(jī)拍照并分析。

2.6RT-qPCR檢測(cè)肺和右心組織中miR-124的表達(dá) 取大鼠肺組織100 mg(或右心組織30 mg)，加入1 mL(或0.5 mL，右心組織) TRIzol中充分研磨裂解后加入氯仿提取總RNA，純化后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定A260/A280比值，比值在1.8～2.0之間用于實(shí)驗(yàn)。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Green 法實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)miR-124的表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)體積為25 μL： cDNA 1 μL，上、下游引物各10 pmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。miR-124的上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAAGGCACGCGGTGA-AT-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；內(nèi)參照U6的上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增完成后，所得結(jié)果由操作系統(tǒng)自動(dòng)生成，目標(biāo)基因的相對(duì)定量按2-ΔΔCt計(jì)算。

2.7Western blot檢測(cè)右心組織中TGF-β1和p-Smad2的表達(dá) 取約50 mg右心組織，剪碎后加入RIPA裂解液，充分研磨后經(jīng)離心提取上清備用。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)用SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用含有5%脫脂奶粉的TBS-T溶液封閉4 h后，分別加入抗TGF-β1、p-Smad2、Smad2和β-actin抗體(1 ∶1 000)，于4℃孵育過(guò)夜。用TBS-T于室溫下洗膜4次(每次15 min)后加入Ⅱ抗，羊抗兔或小鼠IgG(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行比較分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 19.0軟件，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-124在各組大鼠肺和右心組織中的表達(dá)

與control組相比，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠肺組織中miR-124的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，而MCT+miR-124組miR-124的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。4組大鼠右心組織中miR-124的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1. The expression of miR-124 in the lung (A) and right heart (B) tissues in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖1 miR-124在各組大鼠肺和右心組織中的表達(dá)

2 各組大鼠RVSP和MAP的比較

到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前(野百合堿注射5周內(nèi))，MCT+NS組和MCT+GFP組各有2只大鼠死亡，MCT+miR-124組死亡1只，control組無(wú)大鼠死亡，4組間死亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)。MCT+NS組和MCT+GFP組的RVSP均顯著高于control組(P<0.05)，與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組的RVSP顯著降低(P<0.05)；4組動(dòng)物的MAP無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠RVSP和MAP的比較

Table 1.Comparison of RVSP and MAP in each group (mmHg. Mean±SD)

GroupnRVSPMAPControl823.2±1.0128.0±7.0MCT+NS671.9±9.9*115.0±11.6MCT+GFP675.1±17.9*111.0±8.7MCT+miR-124749.3±7.7*#120.0±18.4

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

3 各組大鼠RVHI和RVWI的比較

野百合堿注射5周后，與control組相比，MCT+NS組和MCT+GFP組的RVHI和RVWI均顯著增高(P<0.05)；與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組的RVHI和RVWI均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 各組大鼠右心室天狼星紅染色

天狼星紅染色結(jié)果顯示， control組大鼠右心室心肌細(xì)胞排列整齊，大小較均一，分布較均勻，膠原沉積較少；MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠心肌細(xì)胞肥大且排列紊亂，膠原沉積顯著增多； MCT+miR-124組心肌細(xì)胞排列稍紊亂，與MCT+GFP組相比，心肌細(xì)胞肥大減輕，膠原沉積顯著減少，見(jiàn)圖3。

5 大鼠右心組織中TGF-β1和 p-Smad2蛋白表達(dá)的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，與control組相比， MCT+NS組和MCT+GFP組右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組大鼠右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.Comparison of RVHI (A) and RVWI (B) in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖2 各組大鼠RVHI和RVWI的比較

討 論

肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性增高導(dǎo)致的右心重構(gòu)和右心衰竭是影響PAH患者預(yù)后的重要因素[8]。盡管近年來(lái)，超聲心動(dòng)圖和磁共振成像在右心室解剖和病理評(píng)估上取得了很大的進(jìn)展，但目前PAH右心室重構(gòu)的機(jī)制仍不明確，臨床上尚沒(méi)有直接或選擇性治療右心衰竭的有效方法。因此，尋找一種有效改善右心重構(gòu)和右心功能的方法有重要的臨床意義。

MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH和右心重構(gòu)模型與臨床上右心重構(gòu)和右心衰竭的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程相似，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和可復(fù)制性等特點(diǎn)，是目前常用的研究PAH和右心重構(gòu)的動(dòng)物模型[9]。單劑腹腔或皮下注射MCT(60 mg/kg)可導(dǎo)致大鼠肺動(dòng)脈血管平滑肌和血管外膜成纖維細(xì)胞的異常增殖和遷移，肺內(nèi)小動(dòng)脈中膜肥厚，肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性增高，4～5周可出現(xiàn)右心室重構(gòu)和右心衰竭，甚至死亡[10]。本研究中，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠從MCT注射后第3周開(kāi)始出現(xiàn)體質(zhì)量增幅減少甚至下降，第4周開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)量顯著減少、呼吸困難等右心衰竭癥狀。到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠RVSP和RVHI均顯著高于control組，右心的心肌細(xì)胞肥厚程度、膠原纖維沉積顯著高于control組，表明大鼠右心重構(gòu)模型建立成功。

Figure 3.Over-expression of miR-124 attenuated right ventricular myocardial remodeling induced by monocrotaline (MCT) in rats (Sirius red staining). The scale bar=50 μm.

圖3 miR-124過(guò)表達(dá)減輕野百合堿誘導(dǎo)的大鼠右心室心肌重構(gòu)

Figure 4. The expression of TGF-β1and p-Smad2 in right heart tissues in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖4 各組大鼠右心組織中TGF-β1和p-Smad2蛋白的表達(dá)

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明miR-124在PAH的發(fā)病和進(jìn)展中起著非常重要的作用。本研究的結(jié)果提示，miR-124在野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中的表達(dá)顯著下降，而AAV介導(dǎo)的miR-124過(guò)表達(dá)可顯著降低野百合堿誘導(dǎo)的RVSP和RVWI，減少右心室膠原沉積，減輕右心重構(gòu)。肺動(dòng)脈血管平滑肌和血管外膜成纖維細(xì)胞的異常增殖和遷移是PAH的病理生理基礎(chǔ)。Kang等[5]的研究表明，miR-124在肺動(dòng)脈高壓患者肺組織以及低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠的肺血管平滑肌細(xì)胞中均顯著下調(diào)；miR-124可通過(guò)作用于PTBP1基因進(jìn)而抑制肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖。Wang等[11]研究證實(shí)，miR-124在肺動(dòng)脈高壓患者及牛肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)；過(guò)表達(dá)miR-124能顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖和移行。因此，我們推測(cè)過(guò)表達(dá)miR-124降低肺動(dòng)脈高壓、減輕右心室重構(gòu)的機(jī)制可能與其抑制肺血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，但其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

TGF-β1是一種具有多功能生物學(xué)活性的細(xì)胞因子[12]。TGF-β1與其受體結(jié)合后，可激活其下游的信號(hào)分子Smad2/3，活化的Smad2/3和Smad4結(jié)合，入細(xì)胞核后可調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移、基質(zhì)的形成、損傷修復(fù)和間質(zhì)纖維化等活動(dòng)[13]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1和 p-Smad2在正常大鼠的右心組織中低水平表達(dá)，在MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠右心組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的激活參與了右心重構(gòu)。Long等[14]的研究結(jié)果也表明，TGF-β1抑制劑可降低MCT誘導(dǎo)的PAH,減輕右心重構(gòu)。在本研究中，miR-124過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致TGF-β1和p-Smad2的表達(dá)均顯著下調(diào)，這提示miR-124過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的激活從而改善右心重構(gòu)。但是，由于AAV-miR-124是通過(guò)氣管局部給藥，其在肺組織中的表達(dá)顯著增加，但在右心組織中的表達(dá)與其它3組相比無(wú)顯著差異。因此，肺組織中過(guò)表達(dá)的miR-124并非直接下調(diào)右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達(dá)，而是可能通過(guò)降低肺動(dòng)脈的壓力、減輕肺循環(huán)阻力，進(jìn)而導(dǎo)致TGF-β1和p-Smad2的表達(dá)下調(diào)，從而減輕右心室心肌重構(gòu)。腺相關(guān)病毒是一種無(wú)致病性的人細(xì)小病毒，具有轉(zhuǎn)染效率高、免疫原性低、可感染多種細(xì)胞且能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，是目前基因治療研究最為常用的載體[15-16]。在本研究中，miR-124在肺和右心組織中表達(dá)結(jié)果顯示，AAV-miR-124重組體通過(guò)氣道給藥后主要在肺組織中表達(dá)，表明AAV具有明顯的嗜肺性，這與Halbert等[17]的報(bào)道相一致。4組大鼠在死亡率上無(wú)顯著差異，但與MCT+NS組和MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組大鼠有較低的死亡率，表明AAV介導(dǎo)的miR-124過(guò)表達(dá)有一定的安全性。

綜上所述，本研究通過(guò)AAV介導(dǎo)的miR-124的過(guò)表達(dá)的方法，可有效降低野百合堿誘導(dǎo)的右心室收縮壓、減輕右心重構(gòu)。本研究有望為肺動(dòng)脈高壓和右心重構(gòu)的基因治療提供新的思路。