張令春 褚延樂 王夢妮

1)河南省人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001

急性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是腦外科最常見的疾病之一。近些年來由于經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展導(dǎo)致建筑意外、交通事故以及跌打損傷等引起的顱腦損傷也日漸增多。顱腦損傷患者的病死率極高，即使存活下來，也會給幸存者帶來不同程度的殘疾和心理問題[1]，這些問題會直接或影響其工作和社會行為，給患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅，同時(shí)對這類患者的康復(fù)治療照顧也會給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，創(chuàng)傷性顱腦損傷救治的重大課題就是改善患者的生存質(zhì)量，降低殘疾和病死率。患者在受到創(chuàng)傷性顱腦損傷后會發(fā)生一系列復(fù)雜的生理病理變化[2-4]，除了暴力造成的急性的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的直接損傷、血管破壞等機(jī)械性損傷以外，還包含由于微環(huán)境改變而導(dǎo)致的細(xì)胞因子改變從而觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)所引發(fā)的繼發(fā)性損傷(包括缺血、缺氧、自由基損傷、離子失衡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等)，這兩種損傷結(jié)合引起 TBI患者腦微循環(huán)變化，引起患者腦細(xì)胞的生理功能的異常變化。因此，防止微循環(huán)障礙、促進(jìn)損傷區(qū)微循環(huán)修復(fù)，是常用的治療手段。但是，臨床上傳統(tǒng)的擴(kuò)容及使用自由基清除劑、Ca+拮抗劑等治療方法則效果欠佳。

三七在我國常常被用于治療缺血性腦卒中，它具有消痛散瘀的作用。中藥三七中最主要的化學(xué)成分是三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PHS)，其主要作用是增加腦血流量，降低血黏度，抑制血小板聚集從而改善微循環(huán)[5]。因此，近年來三七總皂苷被廣泛用于治療心腦血管疾病。有研究表明，顱腦損傷后，應(yīng)用三七總皂苷能夠緩解腦水腫，改善血腦屏障的通透性，從而起到腦保護(hù)作用[6]。但是，目前對PNS治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用機(jī)制還不是特別清楚。本研究所采用大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷模型由自由落體法實(shí)現(xiàn)，采用PNS對模型進(jìn)行干預(yù)，采用神經(jīng)行為學(xué)評分對治療結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，Western blot法檢測大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)的促血管生成因子VEGF及FGF表達(dá)的變化，探討PNS修復(fù)創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料購買自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級成年雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量為(200±5)g；注射用血塞通凍干針劑(PNS，規(guī)格：120 mg；昆明制藥集團(tuán)股份有限公司)；FGF抗體、VEGF抗體(Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1 TBI損傷模型制作：大鼠中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型采用 Feeney 自由落體硬膜外撞擊法建立[7]。具體操作方法：采用10%水合氯醛對各組大鼠行腹腔注射(2 mL/kg)麻醉，頭部備皮后將其固定于腦立體定向儀上，常規(guī)消毒和鋪巾后，沿中線切開大鼠的頭頂部皮膚，采用鈍性分離對皮下組織進(jìn)行分離，切開骨膜之后分離，并用牙科磨鉆出骨窗，值得注意的是在操作過程中要盡量保證硬腦膜的完整性。具體操作方法：把撞擊圓錐頭端置于骨窗上，將砝碼從距離骨窗35 cm的高處自由垂直落下，使之撞擊硬膜上的圓錐，以形成中度腦損傷[8]。建模之后清理創(chuàng)傷面、止血，應(yīng)用骨蠟將骨窗封閉，縫合。術(shù)后腹腔注射注射左氧氟沙星。對照組和治療組在模型制作完畢后經(jīng)腹腔分別注射 100 mg/mL生理鹽水和此前制備好的PNS溶液100 mg/mL。在注射過程中，要密切注意大鼠的生理變化，術(shù)后需要單籠飼養(yǎng)。若實(shí)驗(yàn)過程中因操作和其他并發(fā)癥引起死亡時(shí)，則去除該大鼠的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)要注意補(bǔ)充新的大鼠，并記錄其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(切開頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不治療)，治療對照組(制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射生理鹽水)及PNS治療組(制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射PNS，劑量100 mg/kg)。見圖1。

圖1 動物模型制作：A大鼠腦損傷模型制作；B大鼠中度創(chuàng)傷性損傷后

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評分：大鼠麻醉蘇醒后，單籠飼養(yǎng)，分別于損傷后的第3天和第7天的固定時(shí)間點(diǎn)從每組中取出10只大鼠，大鼠的神經(jīng)運(yùn)動感覺功能的系統(tǒng)評估主要采用改良的神經(jīng)損傷程度評分量表(modified neurological severity scores，mNSS)來進(jìn)行評估[9-11]。評分采用雙盲法，具體操作方法：由熟知mNSS評分的2名不知情的實(shí)驗(yàn)員對各組大鼠的運(yùn)動、感覺、平衡以及反射進(jìn)行測試，并詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)。評分表總分為0～18分，重度損傷為13～18，中度損傷為7～12分，輕度損傷為1～6分，正常大鼠的評分為0分。大鼠的神經(jīng)功能采用運(yùn)動、感覺、平衡4個(gè)方面來評價(jià)。

1.2.3 western blot檢測：不同時(shí)間點(diǎn)損傷處組織VEGF及FGF表達(dá)變化，術(shù)后7 d將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺上，無菌條件下分離腦組織，以損傷處為中心，截取大鼠腦組織約2 mm3，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗數(shù)次后置于凍存管中并快速存放于液氮中備用。RAPI裂解組織后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，BCA法測量蛋白濃度，后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜1.5 h，后置于50 g/L的脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，VEGF一抗(1：1 000稀釋)、FGF一抗(1：800稀釋)過夜孵育，用TBST溶液洗膜3次后于辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗溶液中室溫下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，顯影成像，最后用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠mNSS評分以及VEGF及FGF蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)損傷程度評分結(jié)果在模型大鼠進(jìn)行治療后的第3天特定時(shí)間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行 mNSS評分，結(jié)果顯示，在PNS治療后3 d內(nèi)各手術(shù)組間差異不顯著，且假手術(shù)組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)正常；在治療后第7天的同一時(shí)間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行 mNSS評分，對照組的評分則高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠 mNSS 評分比較分)

2.2損傷組織中VEGF及FGF表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示，術(shù)后7 d時(shí)對照組與治療組中VEGF蛋白及FGF蛋白的表達(dá)均高于假手術(shù)組，與對照組相比較治療組中VEGF的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 SCI后28 d 各組大鼠脊髓組織蛋白表達(dá)比較

表2 TBI 7 d后VEGF、FGF蛋白在各組大鼠腦組織中的表達(dá)變化

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與對照組相比，#P<0.05

3 討論

三七總皂苷是三七中的有效活性成分，具有活血化瘀，消腫止痛的功效。實(shí)驗(yàn)研究表明，三七皂苷能夠保護(hù)心腦血管缺血缺氧損傷，且能夠抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[12-15]。

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，車禍和建筑意外導(dǎo)致的腦損傷數(shù)量不斷增加[16-17]。由于引起腦損傷的創(chuàng)傷包含機(jī)械損傷外，還有繼發(fā)性的腦損傷，二者都會引起腦損傷患者腦部微循環(huán)的變化。損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其形態(tài)的變化可引起患者血管管壁組織結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致局部血液流變出現(xiàn)變化，引起微循環(huán)障礙[18-20]，微循環(huán)障礙是局部微環(huán)境損傷的重要病理生理基礎(chǔ)，也是影響患者神經(jīng)恢復(fù)的重要因素。

VEGF在腦組織內(nèi)有比較豐富的表達(dá)，還是生成血管的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善和幫助恢復(fù)損傷腦組織的血液供應(yīng)，是效果最好的促血管生長因子之一。VEGF有強(qiáng)大的促進(jìn)新生血管形成的能力，且能有效促進(jìn)傷口的愈合[21-22]。VEGF也是目前挽救和治療缺血性腦血管疾病和缺血半暗區(qū)腦組織功能損傷的關(guān)鍵所在。近些年對VEGF與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的諸如阿爾茲海默、帕金森等其他疾病之間的關(guān)系的研究也越來越多[23-24]，這足以看出VEGF具有巨大的應(yīng)用前景。已有研究表明，PNS能夠降低大鼠血小板聚集率，延長其頸總動脈血栓形成的時(shí)間，具有抗血栓作用[25]。本研究從神經(jīng)行為學(xué)上證實(shí)，模型組大鼠經(jīng)PNS治療后神經(jīng)行為獲得較為明顯的改善，為PNS向臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。治療組大鼠顱腦損傷區(qū)域VEGF蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組和對照組(P<0.001)，該研究表明PNS在一定程度上能夠促進(jìn)大鼠損傷腦區(qū)域的VEGF的表達(dá)。

FGF有促進(jìn)新生血管形成、提高腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加腦血流量、抑制一氧化氮(NO)產(chǎn)生等功能，因此能夠促進(jìn)腦損傷患者的恢復(fù)[26-28]。本實(shí)驗(yàn)表明，PNS 治療組大鼠損傷區(qū)FGF蛋白表達(dá)也明顯高于假手術(shù)組和對照組(P<0.001)，說明PNS 能夠促進(jìn)大鼠損傷腦組織中FGF的表達(dá)。

綜上，PNS可以增加顱腦損傷大鼠腦損傷區(qū)域VEGF及FGF的表達(dá)量。該研究不僅為PNS治療顱腦損傷提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也開拓了臨床治療顱腦損傷的新思路，也為以后進(jìn)一步研究VEGF和FGF的腦保護(hù)機(jī)制提供了線索。

[1] EDAVETTAL M，GROSS B W，RITTENHOUSE K，et al.An Analysis of Beta-Blocker Administration Pre-and Post-Traumatic Brain Injury with Subanalyses for Head InjurySeverity and MyocardialInjury[J].Am Surg，2016，82(12)：1 203-1 208.

[2] KUROWSKI B G，TREBLE-BARNA A，PITZER A J，et al.Applying Systems Biology Methodology To Ident-ify Genetic Factors Possibly Associated with Recovery after Traumatic Brain Injury[J].J Neurotra，2017，34(14)：2 280-2 290.

[3] PILIPOVIC K，?UPAN?，DOLENEC P，et al.A single dose of PPARγ agonist pioglitazone reduces cortical oxidative damage and microglial reaction following lateral fluid percussion brain injury in rats[J].Prog Neuropsy Biol Psych，2015，59：8-20.

[4] XU X，GAO W，CHENG S，et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms of atorvastatin in a murine model of traumatic brain injury[J].Neuroinflam，2017，14(1)：167.

[5] 吳蘭鷗，詹合琴，閆峻嶺，等.三七皂苷Rg1對大鼠腦缺血_再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].中草藥，2006，37(2)：229-233

[6] 韓金安，匡永勤，周虎田，等.三七總皂甙對家兔腦損傷后腦組織中丙二醛含量變化的影響[J].中國病理生理雜志，2000，16(3)：269-271.

[7] FEENEY D M，BOYESON M G，LINN R T，et al.Responses to cortical injury：Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res，1981，211(1)：67-77.

[8] LI D，MA S，GUO D，et al.Environmental Circadian Disruption Worsens Neurologic Impairment and Inhibits Hippocampal Neurogenesis in Adult Rats After Traumatic Brain Injury[J].Cell Mol Neurobiol，2016，36(7)：1 045-1 055.

[9] HONMA T，HONMOU O，IIHOSHI S，et al.Intrav-enous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat[J].Exp Neurol，2006，199(1)：56-66.

[10] CHEN X，WU S，CHEN C，et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation attenuates microglial-induced inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway following experimental trauma-tic brain injury[J].Neuroinflam，2017，14(1)：143.

[11] ZHANG L，YI L，CHOPP M，et al.Intravenous administration of human umbilical tissue-derived cells improves neurological function in aged rats after embolic stroke[J].Cell Transplant，2013，22(9)：1 569-1 576.

[12] 李韜，曲德英，雷菠，等.三七粉對家兔實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化的影響[J].中醫(yī)研究，2006，19(1)：17-19.

[13] 孫小梅，姚琰，紀(jì)三姣，等.三七總皂甙對冠心病病人血漿內(nèi)顆粒膜蛋白和血小板聚集的影響[J].數(shù)理醫(yī)藥雜志，2001，14(1)：26-27.

[14] LI H，DENG C Q，CHEN B，et al.Total saponins of Panax notoginseng modulate the expression of caspases and attenuate apoptosis in rats following focal cerebral ischemia-reperfusion[J].Ethnopharmaco，2009，121(3)：412-418.

[15] ZHENG M，QU L，LOU Y.Effects of icariin combined with Panax notoginseng saponins on ischemia reperfusion-induced cognitive impairments related with oxida-tive stress and CA1 of hippocampal neurons in rat[J].Phytother Res，2008，22(5))：597-604.

[16] LEE H F，LEE T S，KOU Y R.Anti-inflammatory and neuroprotective effects of triptolide on traumatic brain injury in rats[J].Respir Physiol Neurobiol，2012，182(1)：1-8.

[17] 張文進(jìn).人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對大鼠腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響[D].鄭州大學(xué)，2014.

[18] TAO X G，SHI J H，HAO S Y，et al.Protective Effects of Calpain Inhibition onNeurovascular Unit Injury through Downregulating Nuclear Factor-κB-related Inflammation during Traumatic Brain Injury in Mice[J].Chin Med J (Engl)，2017，130(2)：187-198.

[19] HOU S T，JIANG S X，ZAHARIA L I，et al.Phaseic Acid，an Endogenous and Reversible Inhibitor of Glutamate Receptors in Mouse Brain[J].Biol Chem，2016，291(53)：27 007-27 022.

[20] CHODOBSKI A，CHUNG I，KONIEWSKA E，et al.Early neutrophilic expression of vascular endothelial growth factor after traumatic brain injury[J].Neurosci，2003，122(4)：853-867.

[21] WANG L，WANG J，WANG F，et al.VEGF-Mediated Cognitive and Synaptic Improvement in Chronic Cerebral Hypoperfusion Rats Involves Autophagy Process[J].Neuromolecular Med，2017，19(2/3)：423-435.

[22] REESON P，TENANT K A，GERROW K，et al.Delay-ed inhibition of VEGF signaling after stroke attenuates blood-brain barrier breakdown and improves functional recovery in a comorbidity-dependent manner[J].Neurosci，2015，35(13)：5 128-5 143.

[23] SKLADNEV N V，GANESHAN V，KIM J Y，et al.Widespreadbrain transcriptome alterations underlie the neuroprotective actions of dietary saffron[J].Neurochem，2016，139 (5)：858-871.

[24] EIBEL B，MELISSA M，CLARISSA G，et al.VEGF gene therapy cooperatively recruits molecules from the immune system and stimulates cell homing and angiogenesis in refractory angina[J].Cytokine，2017，91(Supplement C)：44-50.

[25] 孫曉慶，趙明，劉兆平，等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，9(18)：40-41.

[26] PEDERSEN M ?，LARSEN A，PEDERSEN D S.Metallic gold treatment reduces proliferation of inflammatory cells，increases expression of VEGF and FGF，and stimulates cell proliferation in the subventricular zone following experimental traumatic brain injury[J].Histol Histopathol，2009，24(5)：573-586.

[27] WOODBURY M E，IKEZU T.Fibroblast Growth Factor-2 Signaling in Neurogenesis and Neurodegeneration[J].J Neuroim Pharmacol，2014，9(2)：92-101.

[28] CLARKE W E，BBERRY M，SMITH C，et al.Coordination of Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) and Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) Trafficking to Nuclei of Reactive Astrocytes around Cerebral Lesions in Adult Rats[J].Mol Cell Neurosci，2001，17(1)：17-30.