齊安生，宮楓舉，劉　爽，凌紅麗，張興進，邵衛(wèi)星，，孫學(xué)強，

（1. 黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江哈爾濱　150069；2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島　266114；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032；4. 青島蔚藍生物制品有限公司，山東青島　266114）

英國物理學(xué)家John Tyndall在1869年發(fā)現(xiàn)當(dāng)一束光線透過膠體時，從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現(xiàn)一條光亮“通路”。這條光亮“通路”是由于介質(zhì)中粒子對光線散射形成的。這種現(xiàn)象被稱為丁達爾現(xiàn)象，也稱為丁達爾效應(yīng)（Tyndall effect）[1]。

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）學(xué)名豬皰疹病毒1型（Suid herpesvirus 1），屬皰疹病毒甲亞科。豬為PRV的原始宿主，并作為貯主，可感染其它動物，如馬、牛、綿羊、山羊、犬、貓，以及多種野生動物。人類對其有抗性。PRV顆粒直徑約150 nm，內(nèi)含直徑為100 nm的20面體核衣殼，由162個中空的殼粒組成，包括150個六鄰體及12個五鄰體。核衣殼之內(nèi)為線狀卷軸樣基因組，核外殼之外則是脂蛋白囊膜及許多糖蛋白的小纖突。因囊膜的差異，病毒顆粒直徑范圍為120～200 nm，其基因組為雙鏈DNA，G+C含量高達73%。PRV在CsCl中的浮密度為1.731，在蔗糖中的浮密度為1.27～1.29，沉降系數(shù)為1 000～1 100 s[2]。

本實驗用蔗糖密度梯度離心方法，離心PRV細胞培養(yǎng)上清；在離心結(jié)束后通過光束對離心區(qū)帶產(chǎn)生的丁達爾效應(yīng)進行精確分層取樣，得到高純度的病毒，以滿足下游病毒學(xué)和免疫學(xué)研究需要。

1　材料和方法

1.1　病毒樣品、試劑和儀器

偽狂犬病病毒Barth-K61細胞培養(yǎng)上清：青島蔚藍生物制品有限公司提供；蔗糖、PEG20000：國藥產(chǎn)品；截留量為100 KD的透析袋：購自北京索萊寶科技有限公司；超速離心機：日本日立公司CP100WX；超速離心管：規(guī)格為15 mm×96 mm，容積為13 mL；水平轉(zhuǎn)子：型號為P40ST；透射電鏡：JEM-1200EX。

1.2　病毒液的濃縮和透析

取60 mL病毒細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾；將濾液置透析袋中，用100 mmol/L pH7.2的PBS 4 ℃透析過夜，然后用PEG20000固體包埋透析袋后進行濃縮。濃縮后體積約為1 mL。

1.3　不連續(xù)蔗糖密度梯度的配制

以PBS配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、30%、35%、40%、50%、60%的蔗糖密度梯度溶液；將其經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，按濃度由高到低依次加入超速離心管中。加入梯度蔗糖溶液時，可將離心管適度傾斜，沿著管壁緩慢加入，務(wù)求界面分明。總體積約為12 mL。

1.4　離心和區(qū)帶取樣

在密度梯度蔗糖界面上鋪入1 mL病毒濃縮液，約為離心管體積的5%，確保離心管上部有較少空隙；距管口約2～3 mm時將鋪入樣品的離心管放入管套中，于精密天平稱量并配平，然后將管套的螺紋蓋擰緊后懸掛于水平轉(zhuǎn)子P40ST上；在20 ℃條件下30 000 r/min離心4 h；離心結(jié)束后取出離心管，平穩(wěn)置于試管架，用光束從管口垂直照射，標(biāo)記光路上呈現(xiàn)丁達爾效應(yīng)的離心區(qū)帶，逐層吸取出現(xiàn)通路的離心區(qū)帶至不同離心管，即區(qū)帶樣品。

1.5　區(qū)帶樣品的透析、濃縮和電鏡觀察

將約3 mL每個區(qū)帶樣品分別裝入透析袋，于PBS中4 ℃透析過夜，用PEG20000固體包埋濃縮至1 mL。取適量濃縮液，滴至銅網(wǎng)，室溫靜置10 min，用濾紙吸干多余樣品，滴加20 g/L磷鎢酸負(fù)染5 min，晾干后透射電鏡觀察。

2　結(jié)果

2.1　離心區(qū)帶觀察

蔗糖密度梯度離心完成后，在自然光下直接觀察，未見離心區(qū)帶。用光束垂直照射離心管內(nèi)液體，在與光路垂直的角度上觀察，發(fā)現(xiàn)離心管內(nèi)出現(xiàn)4個散射光斑，可觀察到PRV細胞培養(yǎng)上清樣品在不連續(xù)蔗糖密度梯度溶液中共出現(xiàn)4條離心區(qū)帶，自上而下依次編號為區(qū)帶1、2、3和4（圖1）。經(jīng)比對分析，區(qū)帶1位于樣品層和20%蔗糖之間，區(qū)帶2位于30%～35%蔗糖濃度之間，區(qū)帶3位于35%～40%之間，區(qū)帶4位于40%～50%之間。

圖1　密度梯度離心區(qū)帶的丁達爾效應(yīng)

2.2　區(qū)帶樣品電鏡觀察

區(qū)帶樣品經(jīng)過處理后，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，區(qū)帶1和2中未見病毒粒子形態(tài)的顆粒，僅存在小分子量雜蛋白、細胞膜碎片和結(jié)晶物（圖2-A、圖2-B）；區(qū)帶4中存在大量顆粒，直徑約150～180 nm，但無明顯的PRV病毒粒子形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)（圖2-D）；區(qū)帶3中病毒顆粒呈球形，直徑為120～150 nm，其中心是電子密度較高的核衣殼，外圍是電子密度較低的囊膜，囊膜表面有呈放射狀排列的纖突（圖2-C），符合典型的PRV病毒粒子形態(tài)學(xué)特征。

圖2　密度梯度離心區(qū)帶樣品透射電鏡圖片

3　討論

病毒提純是應(yīng)用各種物理和化學(xué)方法，以不使病毒受損和失活為前提，去除宿主細胞組分等非病毒物質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提，病毒微細形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒化學(xué)組分及其遺傳物質(zhì)—DNA或RNA的詳細研究都需要高純度的病毒樣品[3]。病毒提純方法包括沉淀法、層析法、紅細胞吸附法、電泳法、超速離心法和超濾法等。每種方法因原理不同，從而對病毒的天然形態(tài)、活性和提取純度都有不同影響。病毒提純方法的選擇，應(yīng)根據(jù)病毒樣品的來源特點、病毒粒子特性（如是否有血凝活性和囊膜、浮密度大小等）、純度要求和下游實驗要求，選擇一種或幾種方法結(jié)合進行。

超速離心法是病毒提純常用方法之一。其主要原理是在強大的離心力作用下，不同大小的病毒粒子在介質(zhì)中的沉降速度不同，從而達到提純的目的。主要包括3種方法：差速離心法、速度區(qū)帶離心法、等密度梯度離心法。速度區(qū)帶離心法又可根據(jù)所使用的蔗糖、甘油和CsCl等介質(zhì)密度的差異，分為連續(xù)密度梯度和不連續(xù)密度梯度[3]。超離心技術(shù)也是分離純化生物大分子及亞細胞成份的最有用技術(shù)之一，而密度梯度離心法則是其中較為復(fù)雜的一種方法。它可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨力[4]。密度梯度離心技術(shù)的發(fā)展，為進一步分離純化亞細胞組分、染色體、病毒、RNA、DNA及其它生物大分子提供了有效方法，已成為細胞生物學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物工程學(xué)等實驗研究的得力手段[5]。

在密度梯度離心過程中，不同大小顆粒的病毒和蛋白在強大離心力作用下，沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域后就不再沉降，不同分子形成不同區(qū)帶，稱為速度區(qū)帶。在理論上，密度較小的粒子或成分停留在上面幾層，密度較大的停留在下面幾層，因而利用該法可以獲得相當(dāng)純凈的病毒樣品。離心操作結(jié)束后，在普通自然光下，依據(jù)樣品中蛋白濃度不同，通過肉眼直接觀察的主觀性較強，蛋白濃度高時可見速度區(qū)帶，較低時不可見；部分型號離心機標(biāo)配的離心管，為了滿足強大離心力的要求，管壁較厚，透光性差，在自然光下通過肉眼觀察蛋白區(qū)帶難度更大。因此，在離心結(jié)束后，分層取樣操作難度較大，常因操作的主觀差異使本來已經(jīng)離心分層的離心區(qū)帶，在收集時又被混合，使病毒純度不夠，甚至導(dǎo)致試驗失敗，造成珍貴生物材料、實驗儀器設(shè)備的巨大浪費。

丁達爾效應(yīng)是一種光學(xué)物理現(xiàn)象。英國物理學(xué)家約翰·丁達爾（John Tyndall）在1869年首先研究發(fā)現(xiàn)光在粒子大小不同的介質(zhì)中傳播，當(dāng)介質(zhì)中的粒子小于入射光波長（400～700 nm），則發(fā)生光散射，可觀察到光波環(huán)繞粒子而向其四周放射。這種散射現(xiàn)象稱為丁達爾效應(yīng)。當(dāng)介質(zhì)中粒子大于入射光波長很多倍，則發(fā)生光的反射；當(dāng)粒子比入射光波長越小，則光的散射效果越弱。由于溶液粒子直徑一般不超過1 nm，膠體中的粒子大小介于溶液中溶質(zhì)粒子和濁液粒子之間，小于可見光波長（400～700 nm）。鑒于膠體能有丁達爾現(xiàn)象，而溶液幾乎沒有，所以可以采用丁達爾現(xiàn)象來區(qū)分膠體和溶液[1]。

密度梯度離心法一般用不同濃度的蔗糖、甘油或者CsCl，制備連續(xù)密度梯度或不連續(xù)密度梯度介質(zhì)，用于分離大小不同的病毒和蛋白等。光束在粒子大小均一的溶液介質(zhì)中直線傳播。由于溶液粒子直徑遠遠小于入射光波長，散射光強度因粒子體積相對較小而較弱，幾乎不出現(xiàn)丁達爾效應(yīng)。當(dāng)病毒樣品在離心力作用下，在密度梯度的蔗糖中形成不同的離心區(qū)帶，不同區(qū)帶之間以蔗糖等介質(zhì)相隔，形成了“溶液1”-“區(qū)帶1”-“溶液2”-“區(qū)帶2”的多層結(jié)構(gòu)。雖然每個溶液層濃度不同，但均不產(chǎn)生丁達爾效應(yīng)；每個區(qū)帶層中分別是浮密度相同、粒子大小相近的病毒或者蛋白等，而且一般情況下其粒子均小于入射光波長，能夠產(chǎn)生丁達爾效應(yīng)。因此，當(dāng)以光束垂直照射離心管內(nèi)容物表面時，在光路的垂直方向上用肉眼可以觀察到明顯的“斷路-通路-斷路-通路”現(xiàn)象。每1個“通路”代表1個離心區(qū)帶。

病毒及亞單位的培養(yǎng)和提純對疫苗、診斷試劑研究開發(fā)具有重要意義，但大多數(shù)研究都屬于工藝性研究，具有一定的商業(yè)價值，所以相關(guān)研究報道較少[6-7]。在使用密度梯度離心法的研究報告中，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于密度梯度離心區(qū)帶定位的詳細報道[8]。在本試驗中離心用病毒樣品濃度也較低，而且離心機配套使用的超速離心管管壁較厚，普通自然光下難以形成肉眼可見區(qū)帶；利用垂直光束在離心管內(nèi)容物的多層介質(zhì)中形成的丁達爾效應(yīng)，精確對各離心區(qū)帶進行取樣，對各層樣品進行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，區(qū)帶3為病毒層，病毒主要集中在35%～40%界面處，符合PRV的形態(tài)學(xué)特征，經(jīng)分子生物學(xué)和免疫學(xué)鑒定為PRV，提取的病毒純度達到了下游免疫學(xué)試驗研究的需要（相關(guān)試驗數(shù)據(jù)另文發(fā)表）。

密度梯度離心技術(shù)是經(jīng)典的病毒純化方法。殷震等[3]主編的經(jīng)典著作《動物病毒學(xué)》（第2版）中關(guān)于超速離心提純病毒的目的意義、方法、原理、步驟和注意事項進行了詳細闡述，尤其是“密度梯度操作法的操作程序——梯度的分段收集（取樣）”中列舉了4種方法進行離心后取樣，對試驗操作人員的經(jīng)驗和技術(shù)要求較高。本研究將光學(xué)物理現(xiàn)象應(yīng)用于病毒的經(jīng)典病毒純化方法，對完善提高密度梯度離心法進行了有益探索，大大提高了經(jīng)典病毒純化技術(shù)手段的成功率，對試驗操作具有重要指導(dǎo)意義。

參考文獻：

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[2] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 5版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：555.

[3] 殷震，劉景華. 動物病毒學(xué)[M]. 2版. 北京：科學(xué)出版社，1997：1226.

[4] 楊蘇. 密度梯度離心技術(shù)的探討[J]. 寧德師專學(xué)報（自然科學(xué)版），1998（4）：59-61.

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