蘇琳琳，朱　麗，錢祁昇，趙翔玥，呂念詞，鄭曉琳，張?zhí)煊?，柴　俊，張以?/p>

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物健康檢測(cè)與評(píng)價(jià)云中心，云南昆明　650201）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起豬的一種急性高死亡率傳染病[1]，傳播速度快，致病性強(qiáng)，危害嚴(yán)重。PRV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科[2]。PR屬于自然疫原性疾病，被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[3]。豬是該病的自然宿主[4]，包括野豬[5-9]。PRV可以通過(guò)多種途徑在豬群中傳播，包括消化道、呼吸道、生殖道，也可以機(jī)械傳播[10]。為了解云南省豬場(chǎng)中的PR流行情況，從而為預(yù)防和控制該病提供數(shù)據(jù)支持，在云南省部分大中小型豬場(chǎng)隨機(jī)采樣，對(duì)采集的血清進(jìn)行 ELISA檢測(cè)，對(duì)采集的可疑病料進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品 從昆明、曲靖、玉溪、楚雄、大理、宣威、西雙版納等9個(gè)地區(qū)的54個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)，隨機(jī)采集6 555份全血和381份疑似病料（母豬52份、保育豬94 份、公豬精液20份、育肥豬103份、流產(chǎn)胎兒和仔豬112 份）。

1.1.2試驗(yàn)材料 豬偽狂犬病 gE-ELISA、gBELISA 診斷試劑盒（美國(guó) IDEXX 公司）；Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0（Takara大連寶生物公司）；2×Easy SuperMix（大連寶生物公司）；膠回收試劑盒（全式金）；ddH2O（大連寶生物公司）。

1.2　方法

1.2.1血清學(xué)檢測(cè) 將采集的6 555份全血處理后，取其血清，根據(jù)豬偽狂犬病gE-ELISA診斷試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行抗體檢測(cè)。在陰、陽(yáng)性對(duì)照成立的前提下，如果待檢樣品的S/N值≤0.60，判定為PRV gB（gE）抗體陽(yáng)性；如果待檢樣品S/N值＞0.7，判定為PRV gB（gE）抗體陰性。

1.2.2病原學(xué)檢測(cè) 將凍存的組織樣品（主要是脾臟、淋巴結(jié)，少量為腦組織）取出，置室溫解凍；在超凈工作臺(tái)中，用滅菌剪刀、鑷子剪至米粒大小，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滅菌處理好的研缽中，加入液氮研磨；最后分裝到2 mL滅菌離心管中，-70 ℃凍存待檢。

1.2.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中的PRV核苷酸序列，應(yīng)用DNAStar軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物（PRV-F、PRV-R）。引物由（華大基因）合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1　PRV引物

1.2.4樣品DNA提取 根據(jù) Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0 試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行樣品DNA提取。

1.2.5PCR擴(kuò)增 取1 μL所提DNA作為模板，加入12.5 μL 2X Easy Taq SuperMix、9.5 μL dd H2O、1 μL PRV-F、1 μL PRV-R。反應(yīng)體系為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，34個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化測(cè)序 對(duì)PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書做膠回收目的條帶，然后克隆轉(zhuǎn)化；將回收產(chǎn)物將送至華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2　結(jié)果

2.1　血清學(xué)檢測(cè)

2.1.1不同年份 2016—2017年在云南省不同地區(qū)采集的6 555份血清樣品中，PRV gB抗體陽(yáng)性率為88.7%，gE抗體陽(yáng)性率（野毒感染率）為13.5%（表2）。

表 2　不同年份PRV抗體檢測(cè)結(jié)果

2.1.2不同地區(qū) 檢測(cè)結(jié)果顯示：楚雄市的gB抗體陽(yáng)性率最低，為78.5%，但gE抗體陽(yáng)性率（野毒感染率）最高，為21.8%；大理市g(shù)B抗體陽(yáng)性率最高，為95.1%，但野毒感染率最低，為6.0%（表3）。

表3　不同地區(qū)PRV抗體檢測(cè)結(jié)果

2.1.3不同季度 檢測(cè)結(jié)果顯示，第2季度的野毒感染率最高，為20.3%，第1季度最低，為8.7%。不同季度的PRV抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4　不同季度PRV抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2　病原學(xué)檢測(cè)

2.2.1不同年份 對(duì)不同年份送檢的疑似PR病料進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2016、2017年的病原檢出率分別為 22.1%、23.7%，表明云南省的PRV野毒感染較嚴(yán)重（表5）。對(duì)送檢病料的PCR檢測(cè)鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

表5　不同年份送檢病料PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1　部分病料的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2不同地區(qū) 對(duì)2016—2017年云南省不同地區(qū)送檢的疑似病料進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)玉溪市病原檢出率最高（52.6%），德宏市最低（16.4%）。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　不同地區(qū)送檢病料PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.3不同季度 對(duì)不同季度送檢的疑似PRV 感染病料進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各季度的病原檢出率較為均衡，在20%～30%之間。具體結(jié)果見(jiàn)表7。

2.2.4不同豬群 對(duì)云南省不同地區(qū)送檢的不同生產(chǎn)階段豬群病料進(jìn)行 PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，母豬的病原檢出率最高（28.8%），而育肥豬最低（20.4%）。具體結(jié)果見(jiàn)表8。

表7　不同季度送檢病料PCR檢測(cè)結(jié)果

表8　不同生產(chǎn)階段豬群病料 PCR 檢測(cè)結(jié)果

3　分析與討論

目前，我國(guó)應(yīng)用 PRV gE基因缺失活疫苗來(lái)控制該病。因此，豬血清中檢出gE抗體可確診為野毒感染[11]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016、2017年的PRV gE抗體陽(yáng)性率分別為13.2%、13.8%，疑似樣品的病原檢出率分別為22.1%、23.7%。該結(jié)果與楊珊珊[12]等報(bào)道的2016年江蘇省部分地區(qū)PR樣本陽(yáng)性率（43.2%），以及畢俊龍[13]等報(bào)道的2009—2013 年云南省楚雄地區(qū)規(guī)模場(chǎng)PR樣本陽(yáng)性率（37.67%）相比偏低，而接近于鄒敏等[14]報(bào)道的2012—2013 年全國(guó)18 個(gè)省份393 個(gè)豬場(chǎng)檢出PRV gE抗體總體陽(yáng)性率（16.13%）。這表明云南省內(nèi)的PR流行仍然嚴(yán)重，因而要提高對(duì)PR防控的重視，認(rèn)真做好預(yù)防控制工作，將可能產(chǎn)生的損失降低到最小。

從不同地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，玉溪、宣威和西雙版納的PRV野毒感染率較高，表明這3個(gè)地區(qū)的PR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較大。從不同季度樣品檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，4個(gè)季度的野毒感染率較為接近，說(shuō)明PR一年四季均可發(fā)生，沒(méi)有明顯的季節(jié)性，只是在初春和冬季較為多發(fā)。從不同豬群檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，母豬野毒感染率較高，說(shuō)明在云南省存在較為嚴(yán)重的PR野毒感染。這可能與疫苗質(zhì)量、免疫程序、接種方法和養(yǎng)殖戶對(duì)免疫的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)有關(guān)。保育豬野毒陽(yáng)性率高可能與母源抗體的干擾有關(guān)，也可能與母豬垂直傳播有關(guān)；仔豬由于免疫系統(tǒng)還沒(méi)有發(fā)育成熟，對(duì)PRV的抵抗力較弱。因此，母豬和仔豬的PR免疫與預(yù)防工作都應(yīng)該得到重視。

4　結(jié)論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省9個(gè)地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)的PR免疫抗體陽(yáng)性率為88.7%，表明總體免疫效果較好；gE抗體陽(yáng)性率為13.5%，表明云南省仍有一定程度的PR流行；gB抗體陽(yáng)性率偏高的地區(qū)，gE抗體陽(yáng)性率較低，說(shuō)明免疫有助于預(yù)防PR野毒感染；第2季度野毒感染率最高，說(shuō)明PR多發(fā)于低溫季節(jié)；玉溪、宣威和西雙版納等地區(qū)，以及母豬、保育豬、仔豬和公豬精液的PR病原檢出率較高，表明對(duì)于這些地區(qū)、此類豬群，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)防控。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬沛，王和平. 豬偽狂犬病的流行情況及凈化對(duì)策[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2013（4）：23-25.

[2] SKODA R. Detection of neutralizing antibodies against the Aujeszky disease virus in swine in Southern Germany[J]. Berl munch tierarztl wochenschr，1971，84（21）：411-414.

[3] 楊毅. 豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（3）：154-157.

[4] 鄧仕偉，薛春芳，汪勇. 我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)對(duì)豬偽狂犬病的控制[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007（2）：112-115.

[5] LOUKACHOV I I，NIKITINE N G. Aujeszky disease in U.S.S.R[J]. Bulletin-of fi ce international des epizooties，1968，69（11）：2151.

[6] VESELINOVA A，MOTOVSKI A. Several features of Aujeszky disease virus[J]. Veterinarno-meditsinski nauki，1976，13（7）：9-15.

[7] MüLLER T，KLUPP B G，F(xiàn)REULING C，et al.Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe[J]. Epidemiology and infection，2010，138（11）：1590-600.

[8] MüLLER T，KLUPP B G，F(xiàn)REULING C，et al.Pseudorabies virus in wild swine：a global perspective[J].Archives virology，2011，156（10：1691-705.

[9] MAHMOUD H Y，SUZUKI K，TSUJI T，et al.Pseudorabies virus infection in wild boars in Japan[J].Journal of veterinary medical science，2011，73（11）：1535-1537.

[10] CORN J L，STALLKNECHT D E，MECHLIN N M，et al. Persistence of pseudorabies virus in feral swine populations[J]. Journal of wildlife diseases，2004，40（2）：307-310.

[11] TONG W，LI G，LIANG C，et al. A live，attenuated pseudorabies virus strain JS-2012 deleted for g E/g I protects against both classical and emerging strains[J].Antiviral research，2016，130：110-117.

[12] 楊珊珊，徐璇，孫濤，等. 2016年江蘇省部分豬場(chǎng)豬偽狂犬病血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2017，34（8）：17-19.

[13] 畢峻龍，楊培昌，肖俊，等. 2009—2013 年云南省楚雄地區(qū)豬偽狂犬血清流行病學(xué)調(diào)查和防控措施研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（4）：117-120.

[14] 鄒敏，楊旭兵，鄭輝，等. 2012—2013年我國(guó)部分地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（4）：1-5.