喬婷婷，于　歡，段晉偉，劉家祺，白燕雨，郭　耀，高曉莎，張艷冰，霍乃蕊，劉興國，古少鵬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷　030801；2.中國動物疫病預防控制中心，北京　100125）

動物養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量真菌氣溶膠及其代謝產(chǎn)物可引發(fā)多種動物疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅[1]，也極易引起經(jīng)常暴露于真菌氣溶膠中的獸醫(yī)和養(yǎng)殖人員的真菌感染[2]。空氣中大部分真菌孢子可以通過呼吸道或傷口進入人或動物體內(nèi)，引起各種疾病[3-4]。因此，全面了解圈舍空氣真菌菌群結(jié)構(gòu)，對于維護畜舍環(huán)境衛(wèi)生和控制疾病發(fā)生具有重要意義。傳統(tǒng)的真菌研究方法，如顯微鏡觀察和分離培養(yǎng)等，不能準確反映菌群組成情況[5]。研究表明，ERIC-PCR可以用于分析人工培養(yǎng)的混合菌，甚至是天然復雜微生物群落的組成特征[6-8]，Pan等[9]證實ERIC-PCR可以比較不同群落結(jié)構(gòu)特征的差異以及同一群落在一段時間內(nèi)菌群的變化過程。目前，該技術(shù)廣泛應用于菌種分類，以及腸道菌群、廢水處理和發(fā)酵過程中微生物菌群指紋圖譜建立[10-14]，并用于確定畜舍氣載微生物的傳播途徑及畜舍環(huán)境真菌氣溶膠的組成[15-17]。本研究利用ERIC-PCR技術(shù)，分析比較2種結(jié)構(gòu)羊舍氣載真菌菌群結(jié)構(gòu)的整體差異，旨在為羊舍的選擇及環(huán)境控制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　圈舍

羊舍選自山西省晉城市澤州縣規(guī)模化肉羊養(yǎng)殖場。結(jié)構(gòu)分別為雙列式地面結(jié)構(gòu)和雙列式高床結(jié)構(gòu)。羊舍兩側(cè)墻體設窗，屋頂裝有無動力風機。高床平養(yǎng)羊舍設漏縫地板，飼養(yǎng)密度為0.73～1.51 m2/只；地面平養(yǎng)羊舍為水泥地面，飼養(yǎng)密度為0.56～1.29 m2/只。每種結(jié)構(gòu)羊舍分別選擇3棟羊舍作為研究對象。

1.2　樣本采集及處理

空氣樣本采集使用AGI-30采樣器（遼寧康潔），采樣基質(zhì)為超純水（15 mL），采樣流量為8 L/min，時間為30 min；分別于四季采集樣本，每個季節(jié)連續(xù)采集3次，每次3個重復；采樣高度與羊呼吸高度一致，采樣同時測定溫度、相對濕度和風速等環(huán)境參數(shù)（表1）；采樣結(jié)束后低溫保存。

1.3　DNA提取

將重復采集的液體樣本混合后，在馬鈴薯葡萄糖肉湯（Solarbio，P9240）中富集培養(yǎng)，使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2300）提取DNA，用NanoDrop ND-1000（美國NanoDrop）測定DNA濃度，OD260與OD280比值在1.8～2.0之間的可以用作PCR擴增模板。

1.4　ERIC-PCR擴增

表1　采樣點環(huán)境參數(shù)

ERIC引物由北京擎科生物公司合成，序列為：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3′和5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。

擴增反應體系為20.0 μL，含10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，rTaq（5 U/μL）0.2 μL，引物（10.0 mol/L）各1.0 μL，模板DNA（100.0 ng/μL）0.2 μL，ddH2O 14.0 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，90 ℃變性30 s，52.5 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min（32個循環(huán)），72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，點樣量為5.0 μL，用凝膠成像系統(tǒng)（UVP）拍照后分析結(jié)果。

1.5　ERIC-PCR指紋圖譜統(tǒng)計分析

對ERIC-PCR指紋圖譜，利用QuantityOne 4.6.2 軟件進行UPGMA（Unweighted pair group mean average）聚類分析，并計算相似性指數(shù)；采用Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)進行多樣性分析[18]。

2　結(jié)果與分析

2.1　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群的ERIC-PCR圖譜

ERIC-PCR圖譜結(jié)果顯示，各樣本DNA片段長度在100～2 000 bp之間不等，少量在2 000 bp以上（圖1）；樣本間存在一些相同譜帶，可見樣本間存在共有優(yōu)勢菌群；高床羊舍樣本的擴增條帶數(shù)多于地面羊舍，并以冬季差別最為明顯（泳道10～12、22～24）。

圖1　羊舍氣載真菌菌群ERIC-PCR指紋圖譜

2.2　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群結(jié)構(gòu)相似性分析

聚類樹狀圖可見多數(shù)樣本按照羊舍結(jié)構(gòu)形成分枝，表明羊舍結(jié)構(gòu)對空氣真菌菌群結(jié)構(gòu)有影響；相同羊舍同一季節(jié)樣本聚集在一個分枝，說明同一季節(jié)羊舍內(nèi)真菌菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定（圖2）。高床平養(yǎng)舍內(nèi)空氣真菌菌群在不同季節(jié)的相似度為22.6%～74.4%，地面平養(yǎng)羊舍相似度為9.1%～85.4%，表明同一羊舍不同季節(jié)之間真菌菌群結(jié)構(gòu)變化較大（表2）。

圖2　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群聚類分析樹狀圖

表2　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群指紋圖譜的相似度 單位：%

高床平養(yǎng)羊舍各季節(jié)樣本相似度為春季56%～73.5%、夏季25.6%～70.5%、秋季67.7%～70.4%和冬季26.8%～53.7%；地面平養(yǎng)羊舍樣本相似度為春季27.2%～60.7%、夏季50.6%～68.8%、秋季35.4%～73.7%和冬季24.5%～46.9%（表2）。

2.3　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群多樣性和優(yōu)勢度分析

Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)分別表示羊舍空氣可培養(yǎng)真菌菌群的多樣性和優(yōu)勢度。結(jié)果顯示高床平養(yǎng)羊舍可培養(yǎng)真菌菌群的多樣性指數(shù)高于地面平養(yǎng)羊舍，但優(yōu)勢度指數(shù)偏低。其中高床羊舍可培養(yǎng)真菌菌群多樣性為春季＞秋季＞夏季＞冬季，優(yōu)勢度為冬季＞夏季＞秋季＞春季；地面羊舍為夏季＞春季＞秋季＞冬季，優(yōu)勢度為冬季＞秋季＞春季＞夏季（表3）。

表3　羊舍氣載可培養(yǎng)真菌菌群的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)

3　討論與結(jié)論

ERIC-PCR技術(shù)可以通過不同樣品之間條帶分布變化、數(shù)量增減和亮度變化等信息，判斷樣品中菌群結(jié)構(gòu)的變化[20-21]，并廣泛應用于腸道菌群、廢水處理以及發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)監(jiān)測。苗增民[17]借助計算機軟件，對不同結(jié)構(gòu)兔舍氣載真菌擴增圖譜分析后發(fā)現(xiàn)，封閉式兔舍的多樣性高于半封閉式兔舍。本試驗通過對羊舍可培養(yǎng)真菌樣本的ERC-PCR圖譜分析發(fā)現(xiàn)，泳道代表的樣本根據(jù)羊舍結(jié)構(gòu)形成分枝，高床羊舍的多樣性高于地面羊舍，且存在一定優(yōu)勢菌群，表明羊舍結(jié)構(gòu)對氣載真菌的多樣性有影響。熊云梅[22]研究發(fā)現(xiàn)了牛舍內(nèi)氣載微生物含量具有明顯的季節(jié)變化。Ana等[23]也提出真菌分布具有明顯的季節(jié)變化。本次檢測發(fā)現(xiàn)同一結(jié)構(gòu)羊舍在不同季節(jié)的圖譜間相似性較低，也說明季節(jié)在一定程度上會影響羊舍氣載真菌分布。季節(jié)變化可引起羊舍溫度和相對濕度等環(huán)境參數(shù)變化，這些變化會影響真菌菌群分布。研究證明羊舍空氣真菌含量與溫度呈正相關，與相對濕度呈負相關[24]；Lin等[25]也提出在25～30 ℃、相對濕度60%～70%、風速＞1 m/s條件下，真菌氣溶膠濃度的總菌落計數(shù)最高。綜上所述，認為圈舍結(jié)構(gòu)影響真菌菌群的多樣性，而且真菌菌群種類的分布也受季節(jié)影響。

多樣性和優(yōu)勢度是微生物群落的重要性質(zhì)。目前對空氣真菌菌群的多樣性和優(yōu)勢度研究較少。本試驗借用了生態(tài)學上Shannon-Wiener公式和Simpson公式，計算各樣本圖譜條帶的多樣性指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)。結(jié)果顯示，高床羊舍的多樣性指數(shù)較高，優(yōu)勢度指數(shù)較低，說明高床羊舍空氣環(huán)境真菌種群豐富度較高，真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)復雜，但優(yōu)勢菌群不明顯，而地面羊舍相反，提示菌群優(yōu)勢度增加可能會引起菌群多樣性減少。這與王燚等[26]的觀點相同。冬季2種結(jié)構(gòu)羊舍氣載真菌菌群多樣性指數(shù)最低，優(yōu)勢度指數(shù)最高，說明冬季羊舍空氣環(huán)境真菌的多樣性較少或者真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)簡單，但是優(yōu)勢菌群明顯，說明某一優(yōu)勢菌的增加會影響菌群的多樣性。

ERIC-PCR技術(shù)雖然不能確定羊舍空氣中所含真菌的具體種類，但能直觀反映空氣中真菌群落組成信息。若羊舍空氣中某一優(yōu)勢菌大量存在，勢必引起 DNA指紋圖譜發(fā)生變化，因此可以為羊舍空氣真菌的監(jiān)測和環(huán)境控制提供依據(jù)。

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