程燕詠　王佳怡　蔣云鳳　孫宇

七氟烷是最常用的吸入麻醉藥，具有代謝率高、起效快、恢復(fù)快等特點。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷暴露與嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)副作用有關(guān)，如大腦結(jié)構(gòu)異常、認知功能障礙、異常行為、自閉癥等[1-3]。我們早先的研究也驗證了長時間七氟烷暴露，能使發(fā)育期及成年大鼠產(chǎn)生認知功能障礙[4-5]，猜測可能是激活了凋亡途徑進而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[6]，然而其具體機制尚未被闡明。

最近的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子和細胞因子，產(chǎn)生強大的神經(jīng)保護作用[7-10]。注射BMSCs可改善鼠類缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[11]。臨床試驗表明，基于間充質(zhì)干細胞的治療是安全有效的[12-13]。但尚無研究證實BMSCs是否能改善七氟烷導(dǎo)致的神經(jīng)毒性損傷。

本實驗嘗試應(yīng)用BMSCs預(yù)處理干預(yù)七氟烷對原代神經(jīng)元的凋亡和細胞活性產(chǎn)生的影響，探索BMSCs在緩解神經(jīng)毒性損傷中起的作用；并通過檢測培養(yǎng)液上清中的炎癥因子TNFα水平，探索BMSCs通過抗炎、抗免疫失調(diào)機制產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的可能性，為防治七氟烷造成的神經(jīng)毒性損傷提供新的思路。

1　材料和方法

1.1　主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、Neuron-basal培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；多聚賴氨酸（Sigma公司， 美國）；caspase-3 抗體、β-actin 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；電轉(zhuǎn)液、電泳液 （生工生物工程有限公司）；MTT檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒 （南京建成科技有限公司）；ELISA檢測試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；超敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GE公司，美國）；多功能酶標儀（BioTek公司，美國）。

1.2　細胞培養(yǎng)

1.2.1原代神經(jīng)元的分離培養(yǎng)

50μg/mL的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，37℃過夜，吸除賴氨酸，PBS清洗晾干后備用。取出生24 h內(nèi)的SD乳鼠 （中科院上海生命科學(xué)研究院提供），處死后75%乙醇消毒，無菌條件下將頭部剪下，置于盛有預(yù)冷DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。分離出大腦，仔細剝除軟腦膜和血管后，快速將腦組織移入另一盛有預(yù)冷DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將腦組織剪成大小約1 mm3的碎塊，加入0.25%胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化25 min后取出。終止消化后移入離心管，反復(fù)輕輕吹打使其成為細胞懸液，1 500 r/min離心10 min，棄上清。重懸靜置后篩網(wǎng)過濾，再次離心棄上清，加接種培養(yǎng)液對細胞重懸后靜置，以5×105cells/mL的細胞密度接種于多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)皿中。置于37℃培養(yǎng)箱中，4 h后換成含2%B27的Neuron-basal培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第3天進行半換液，第5天開始BMSC預(yù)處理。倒置相差顯微鏡下觀察原代神經(jīng)元的生長情況。

1.2.2BMSC的分離培養(yǎng)

取6 d齡雄性SD大鼠（上海第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供），脫頸處死后75%乙醇消毒，無菌條件下取股骨，用5 mL DMEM低糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 mg/mL青、鏈霉素）沖洗骨髓腔。沖洗得到的細胞懸液接種于6 cm培養(yǎng)皿。48～72 h半換液，之后每3天換液1次。細胞生長融合至80%～90%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞備用。

1.3　BMSC預(yù)處理及七氟烷暴露

BMSC的預(yù)處理以運用Transwell（24孔，0.4μm孔徑，Costar）構(gòu)建非接觸性共培養(yǎng)體系的形式完成。以是否接受BMSCs預(yù)處理（BMSCs+/BMSCs-）和是否接受七氟烷暴露（SEV+/SEV-）為標準，分為4組。①SEV-BMSCs-組：原代神經(jīng)元在孔下部，DMEM低糖完全培養(yǎng)基在膜上；②SEV-BMSCs+組：原代神經(jīng)元在孔下部，200 μL BMSCs（1×105cells/mL）在膜上；③SEV+BMSCs-組：原代神經(jīng)元在孔下部，DMEM低糖完全培養(yǎng)基在膜上；④SEV+BMSCs+組：原代神經(jīng)元在孔下部，200 μL BMSCs（1×105cells/mL）在膜上。BMSCs預(yù)處理在正常培養(yǎng)箱中維持24 h。結(jié)束后，4組的上層小室均被取走，下層的培養(yǎng)基也均被更換。③④組隨即進行七氟烷暴露 （4%七氟烷暴露6 h）。①②組繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后各組同時結(jié)束，取樣檢測。

1.4　Western Blot檢測細胞凋亡

細胞蛋白的抽提和定量按照說明書操作。蛋白樣品每次使用前煮沸5 min。配置12%凝膠，80 V恒壓電泳至染料剛出膠底部，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍后加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3遍后顯色。以Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.5　MTT檢測細胞活性

每孔加入100μL MTT，放入培養(yǎng)箱避光孵育4 h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入600μL DMSO，低速震蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下測定吸光度。

1.6　LDH檢測細胞活性

收集各組培養(yǎng)液樣本進行LDH檢測。按說明書步驟加標準品繪制標準曲線?？瞻卓准尤?5μL雙蒸水；標準孔加入5μL雙蒸水和20μL丙酮酸標準應(yīng)用液；測定孔加入20μL待測樣品，5μL輔酶Ⅰ應(yīng)用液；對照孔加入5μL雙蒸水和20μL待測樣品；各孔均加入25μL基質(zhì)緩沖液?；靹?，37℃溫浴15 min后各孔加入25μL 2，4-二硝基苯肼?；靹颍?7℃溫浴15 min后各孔加入250μL NaOH溶液?；靹?，室溫靜置5 min，用酶標儀在450 nm波長測定OD值。

1.7　ELISA檢測TNFα水平

各組培養(yǎng)液樣本按說明書步驟加標準品繪制標準曲線。樣本孔每孔加入50μL檢測緩沖液和50 μL樣本，每孔加入50μL檢測抗體。封板膜封板，300 r/min振蕩，室溫孵育2 h。棄液，每孔加洗液洗板6次。每孔加100μL稀釋的鏈霉親和素。封板膜封板，300 r/min振蕩，室溫孵育45 min。棄液，每孔加洗液洗板6次。每孔加入100μL顯色底物，避光室溫孵育30 min。加入100μL反應(yīng)終止液，用酶標儀測定在450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值。

1.8　數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析方法

利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算各測量項目的均值和標準差，組間差異采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　七氟烷處理對原代神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

4%七氟烷處理6 h后，相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代神經(jīng)元細胞分布稀疏，貼壁性降低，壞死脫落增加，部分神經(jīng)元崩解。神經(jīng)元胞體回縮，突起之間連接斷裂；BMSC預(yù)處理可以減少七氟烷對原代神經(jīng)元產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)上的改變（圖1）。

圖1　各組原代神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)改變（100×）Fig.1　Morphological changes of primary cultured neuron in each group(100×)

2.2　BMSC對七氟烷暴露后原代神經(jīng)元凋亡的影響

Western Blot結(jié)果顯示，七氟烷暴露對于未進行BMSC預(yù)處理組的原代神經(jīng)元細胞凋亡率的影響具有顯著差異 （P<0.01）；BMSC預(yù)處理可明顯降低由七氟烷暴露引起的原代神經(jīng)元凋亡（P<0.01）；而未經(jīng)七氟烷暴露組的原代神經(jīng)元中，BMSC預(yù)處理對其凋亡率的影響沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。說明BMSC預(yù)處理可減輕七氟烷暴露導(dǎo)致的原代神經(jīng)元凋亡。

圖2　Western Blot檢測各組原代神經(jīng)元細胞凋亡情況Fig.2　The cell apoptosis of primary cultured neuron in each group by Western Blot examine

2.3　BMSC對七氟烷暴露的原代神經(jīng)元細胞活性的影響

MTT及LDH實驗的統(tǒng)計分析結(jié)果均顯示，七氟烷暴露對于未進行BMSC預(yù)處理組的原代神經(jīng)元細胞活性的影響具有統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05）；BMSC預(yù)處理可緩解由七氟烷誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元活性降低，差異顯著（P<0.05）；在未接受七氟烷處理組的原代神經(jīng)元中，BMSCs預(yù)處理對其細胞活性沒有明顯影響（圖3）。以上數(shù)據(jù)表明，BMSCs預(yù)處理可改善七氟烷暴露導(dǎo)致的原代神經(jīng)元活性降低。

圖3　MTT和LDH檢測各組原代神經(jīng)元細胞活性情況Fig.3　The cell viability of primary cultured neuron in each group by MTT and LDH examine

2.4　BMSC影響七氟烷暴露的原代神經(jīng)元TNFα水平

ELISA檢測顯示，七氟烷暴露增加了未進行BMSC預(yù)處理的原代神經(jīng)元上清TNFα水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01）；BMSC預(yù)處理可降低由七氟烷誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元上清TNFα分泌水平，差異顯著（P<0.01）；在未接受七氟烷處理組的原代神經(jīng)元中，BMSC預(yù)處理對上清TNFα水平的影響沒有統(tǒng)計學(xué)差異。說明BMSC預(yù)處理可以減少七氟烷導(dǎo)致的TNFα大量釋放。

3　討論

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)七氟烷暴露會導(dǎo)致原代神經(jīng)元細胞形態(tài)改變，引起細胞凋亡，細胞活性降低及TNFα釋放。TNFα有導(dǎo)致腫瘤細胞壞死、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用，又可作為應(yīng)激反應(yīng)指標。七氟烷暴露后，原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中TNFα水平明顯增高，說明七氟烷使原代神經(jīng)元處于一種免疫失調(diào)、炎癥反應(yīng)過度的狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，利用非接觸性共培養(yǎng)模型完成的BMSC預(yù)處理可以緩解這些損傷。BMSC可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和其他與神經(jīng)保護相關(guān)的可溶性因子[7-9]，由此減少七氟烷導(dǎo)致的原代神經(jīng)元的凋亡，改善細胞活性的降低，減少TNFα釋放。說明BMSC預(yù)處理可以減輕七氟烷導(dǎo)致的神經(jīng)毒性損傷，且這種治療效果可能是通過改善七氟烷暴露后的炎癥反應(yīng)和免疫功能失調(diào)達成的。這些發(fā)現(xiàn)為防治七氟烷的神經(jīng)毒性損傷提供了新的見解。鑒于七氟烷是一種被廣泛應(yīng)用于臨床的吸入麻醉劑，我們應(yīng)該對其臨床使用持有更謹慎的態(tài)度。

考慮到七氟烷引起的原代神經(jīng)元凋亡是一種氧化級聯(lián)反應(yīng)，此類損傷一旦啟動將很難被克服[14]。故本研究選擇在七氟烷暴露之前用BMSC進行預(yù)處理。七氟烷造成的神經(jīng)損傷與其他不可預(yù)期的神經(jīng)損傷不同，絕大部分發(fā)生七氟烷暴露的手術(shù)都是擇期手術(shù)，BMSC的預(yù)防性處理也是符合基本臨床情況的。

BMSC已被證實可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和其他胞外囊泡（EVs），并由此發(fā)揮其免疫抑制活性，且神經(jīng)保護功能也可能與細胞間接觸無關(guān)[15]。本研究的BMSCs預(yù)處理方法是通過Transwell小室構(gòu)建的非接觸性共培養(yǎng)體系來完成的。因此，我們的研究也支持以上觀點，認為BMSC的抗七氟烷神經(jīng)毒性作用是通過分泌可溶性因子介導(dǎo)的。BMSC分泌的EVs包括外泌體、核外顆粒體、細胞微泡、微粒和凋亡小體等[16]。鑒于大多數(shù)EVs能夠通過血腦屏障且相對穩(wěn)定，確定具體的作用成分將對研究各種神經(jīng)毒性損傷的治療具有重大意義。

本研究存在一定的局限性。首先，BMSC是從新生SD大鼠中獲取的，而原代神經(jīng)元是從新生小鼠中獲得。在動物實驗中，人類、小鼠、大鼠的異種BMSC已被廣泛應(yīng)用[17-19]，具有低免疫原性的優(yōu)點，這也使其成為臨床應(yīng)用的理想工具。自體和同種異體BMSC已被證明可在人類中安全使用[20-21]。我們計劃分離出BMSC具體的有效成分進行下一步動物實驗，并發(fā)現(xiàn)其具體機制，由此更好地避免異種之間可能發(fā)生的排斥反應(yīng)。其次，本次研究觀察的是七氟烷暴露后即刻的損傷，這可能不能完全模擬神經(jīng)損傷的完整狀態(tài)。在進一步的研究中，我們將延長觀察期。第三，這些結(jié)果均基于細胞實驗，仍需要在動物實驗中得到證實。

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