李季平，郭　婕

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

車前草為車前科多年生草本植物，為傳統(tǒng)草藥，在全世界廣泛使用[1].藥典中入藥的大部分是其干燥全草，具有清熱、利尿、涼血、祛痰、解毒等功效[2].此外，車前草還可食用[3]，主要以嫩葉和芽供食用.車前草中含多糖、黃酮、生物堿等[4]成分，其中黃酮類為車前草的主要有效成分之一，車前草的止咳、祛痰、抗哮喘作用與其有關(guān)[5].本實(shí)驗(yàn)采用單因素及正交試驗(yàn)，分析影響野生車前草總黃酮提取率的主要因素，并篩選出最佳提取條件.旨在為野生車前草的黃酮提取及合理利用提供一定的理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

車前草全草，2016年9月采于周口師范學(xué)院內(nèi).清洗干凈，通風(fēng)處晾干，用剪刀將其剪碎，長(zhǎng)度約為2 mm，備用.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照總黃酮含量測(cè)定的經(jīng)典方法[6]并稍加修改，求得標(biāo)準(zhǔn)方程為y=13.257x-0.003，R2= 0.999．其中y為吸光值，x為蘆丁濃度(mg/mL)．

1.2.2單因素試驗(yàn)

乙醇濃度的篩選：分別設(shè)置乙醇為30%，45%，60%，75%，90%，功率為450 W，微波處理2 min，提取兩次，合并提取液，研究乙醇濃度對(duì)車前草總黃酮提取率的影響.料液比的篩選：設(shè)置75%乙醇，功率為450 W，微波處理2 min，研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)對(duì)車前草總黃酮提取率的影響.微波處理時(shí)間的篩選：設(shè)置75%乙醇，功率為450 W，料液比1∶20，研究不同微波處理時(shí)間1、2、3、4、5 min對(duì)車前草總黃酮提取率的影響.微波功率的篩選：研究不同微波功率150、300、450、600、750 W對(duì)車前草總黃酮提取率的影響.

1.2.3正交試驗(yàn)

采用L9(34)正交表對(duì)以上四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，確定車前草總黃酮的最佳提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排見(jiàn)表1.

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素試驗(yàn)

2.1.1車前草總黃酮提取率與乙醇濃度的關(guān)系

圖1表明，隨著乙醇濃度的增加，車前草總黃酮提取率呈先增加后逐步減少的趨勢(shì)，乙醇濃度至75%時(shí)，達(dá)到最高為2.41%.這主要是由于以低濃度乙醇作為提取劑時(shí)，提取液中水溶性雜質(zhì)較多，而以高濃度乙醇提取時(shí)易帶入色素及脂溶性物質(zhì)，這些物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而降低黃酮的提取率[7]，所以初步選擇75%乙醇為提取劑.

圖1　總黃酮提取率與乙醇濃度的關(guān)系圖

2.1.2車前草總黃酮提取率與料液比的關(guān)系

圖2　總黃酮提取率與料液比的關(guān)系圖

圖2表明，料液比1∶10至1∶15時(shí)，提取劑用量過(guò)小，車前草總黃酮提取率較低，當(dāng)料液比增至1∶20時(shí)提取率達(dá)到最高為2.55%.料液比繼續(xù)增加，總黃酮提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì).料液比較小時(shí)，固液相中黃酮的濃度差偏小，提取不完全；提高溶劑用量，固液相中黃酮的濃度差增大，使得黃酮提取率增加[8]，但同時(shí)可能會(huì)使其他物質(zhì)溶出增多.故初步選擇料液比為1∶20.

2.1.3車前草總黃酮提取率與微波時(shí)間的關(guān)系

圖3　總黃酮提取率與微波時(shí)間的關(guān)系圖

圖3表明，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，車前草黃酮的提取率會(huì)隨著微波時(shí)間的增加而提高；但微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微波產(chǎn)生的熱效會(huì)對(duì)黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生了破壞作用[9]，使得提取率下降.微波處理3 min時(shí)，提取率達(dá)到最高為2.64%.故初步選擇微波時(shí)間為3 min.

2.1.4車前草總黃酮提取率與微波功率的關(guān)系

圖4　 總黃酮提取率與微波功率的關(guān)系圖

圖4表明，微波功率從150 W增至450 W時(shí)，車前草總黃酮提取率有上升趨勢(shì)，當(dāng)微波功率為450 W時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高為2.77%.但微波功率增至600 W、750 W時(shí)，黃酮提取率開(kāi)始下降.其原因可能是，微波功率過(guò)大時(shí)溫度較高使可溶性蛋白質(zhì)溶出發(fā)生變性，影響了細(xì)胞的破裂從而阻礙了黃酮的溶出，降低了總黃酮的提取率[10].為保證總黃酮充分提取，同時(shí)防止過(guò)高溫度引起有效成分的分解，故初步選擇微波功率為450 W.

2.2　優(yōu)化結(jié)果

由表2可知，影響車前草總黃酮提取率的順序從低到高依次為：微波功率、微波處理時(shí)間、料液比、乙醇濃度.表3方差分析顯示各因素對(duì)車前草總黃酮提取率均有一定影響，其中乙醇濃度與料液比的影響表現(xiàn)顯著(P<0.05).綜合表2和表3結(jié)果可知，車前草總黃酮的最佳提取條件恰與正交試驗(yàn)表中的試驗(yàn)號(hào)5條件相重合，即乙醇濃度為75%，料液比為1∶20，微波時(shí)間為4 min，微波功率為300 W.經(jīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)，在此條件下總黃酮的提取率為2.91%，與正交試驗(yàn)表中試驗(yàn)號(hào)5的提取率2.908%相符.

表2　L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析

3　結(jié)論

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度法測(cè)定野生車前草中總黃酮的含量.并采用微波輔助法，以車前草總黃酮提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)篩選及優(yōu)化車前草總黃酮的最佳提取工藝條件.結(jié)果顯示，乙醇濃度與料液比對(duì)車前草總黃酮提取率的影響顯著.同時(shí)確定了車前草中總黃酮的最佳提取工藝為：75%乙醇濃度、料液比為1∶20、微波處理4 min、微波功率為300 W，此時(shí)車前草中總黃酮的提取率為2.91%.

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