古紅梅，溫曉曉，王　哲，谷喜樂(lè)

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

近幾年，重金屬污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化.因此重金屬污染已引起世界各地人們的廣泛關(guān)注[1-4].在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，適量的重金屬離子可能會(huì)對(duì)植物有一定的益處，但當(dāng)環(huán)境中重金屬離子超過(guò)某一臨界值時(shí)，就會(huì)對(duì)植物的生理生化特性產(chǎn)生很大的影響[5].本實(shí)驗(yàn)所用到的重金屬銅，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的一種微量元素，是一些蛋白質(zhì)和氧化還原酶如超氧化物歧化酶等關(guān)鍵組成成分，因?yàn)樗鼤?huì)儲(chǔ)存在葉綠體中，所以可以進(jìn)行光合作用，又是氧化還原酶的組成成分，也可以影響氧化還原過(guò)程[6-8].蠶豆因?yàn)槠潴w細(xì)胞染色體共有六對(duì)，且染色體比較大，是很好的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料，并且蠶豆根尖細(xì)胞含有較多的分裂細(xì)胞，制片比較簡(jiǎn)單，容易觀察，因此想要測(cè)知污染物的環(huán)境毒理效應(yīng)可以借用蠶豆根尖分裂細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀測(cè)[9-11].利用蠶豆作材料來(lái)研究有絲分裂、無(wú)絲分裂、染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)也是國(guó)內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測(cè)常用的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)技術(shù)[12-13].本實(shí)驗(yàn)以蠶豆為材料，利用不同濃度的氯化銅對(duì)蠶豆萌發(fā)和生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行脅迫處理，以此來(lái)探究氯化銅的處理濃度和處理時(shí)間對(duì)蠶豆種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)及根尖細(xì)胞的細(xì)胞核和染色體的影響，在理論上揭示重金屬脅迫對(duì)蠶豆的損傷機(jī)理，在生產(chǎn)應(yīng)用上為防治重金屬危害植物提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

市售普通蠶豆.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑制備

氯化銅脅迫液的制備：首先稱取5 mg氯化銅(優(yōu)級(jí)純)放入燒杯中，加入少量水，然后全部溶解后移入500 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即配成10 mg/L的氯化銅溶液.用相同的方法配制濃度分別為20，40，80，120，240 mg/L的氯化銅溶液.

固定液的制備：無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1.

解離液的制備[11]：量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸43 mL，倒入燒杯中，玻璃棒引流至500 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，此溶液即為1 mol/L的鹽酸.

染色液的制備：制備改良的苯酚品紅染色液.

1.2.2蠶豆種子萌發(fā)前處理

挑選無(wú)病蟲(chóng)害、飽滿的蠶豆種子，用蒸餾水漂洗2次，再用2%的H2O2浸泡消毒10 min，洗凈后用蒸餾水浸種1 d，一部分種子用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，另一部分種子用于細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn).

1.2.3蠶豆種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

將浸泡1 d后的蠶豆種子分組放在小燒杯里，每組10顆蠶豆.第一組為對(duì)照，蒸餾水浸泡，第二至七組分別用10，20，40，80，120，240 mg/L的氯化銅溶液浸泡，浸種1 d后，放入大培養(yǎng)皿中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，培養(yǎng)期間每天補(bǔ)充各組對(duì)應(yīng)的處理液.每天記錄萌發(fā)情況(發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng))，連續(xù)統(tǒng)計(jì)4 d.發(fā)芽率=(萌發(fā)粒數(shù)/總粒數(shù))×100%；芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)分別取10粒的平均值.若芽和根彎曲，則可先用細(xì)線測(cè)量，再將細(xì)線拉直，用毫米刻度尺測(cè)出細(xì)線長(zhǎng)度.

1.2.4蠶豆主根根尖細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)

將浸泡1 d后的蠶豆種子放入大培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每天補(bǔ)充水分，待主根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，分組處理主根.第1組為對(duì)照組，不做銅離子脅迫處理；第2組為10 mg/L氯化銅溶液處理；第3組為20 mg/L氯化銅溶液處理；第4組為40 mg/L氯化銅溶液處理；第5組為80 mg/L氯化銅溶液處理；第6組為120 mg/L氯化銅溶液處理；第7組為240 mg/L氯化銅溶液處理.處理時(shí)間為4 d，處理結(jié)束后，根尖恢復(fù)培養(yǎng)1 d，取材制作裝片，觀察染色體畸變情況及產(chǎn)生微核情況.染色體畸變率=(染色體畸變細(xì)胞總數(shù)/有絲分裂細(xì)胞總數(shù))×100%[13]；微核率=(觀察到的微核數(shù)目/觀察到的細(xì)胞數(shù)目)×1 000‰.

1.2.5蠶豆側(cè)根根尖細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)

將浸泡1 d后的蠶豆種子放入大培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每天補(bǔ)充水分，待主根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，切去部分主根，使側(cè)根充分發(fā)育，待側(cè)根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，分組處理側(cè)根.處理方法同主根.取材制作裝片后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察.

取材時(shí)間設(shè)定：蠶豆根尖細(xì)胞在細(xì)胞分裂時(shí)期分裂細(xì)胞并不同步，所以不管何時(shí)處于分裂期的細(xì)胞只有一小部分.在一天中，細(xì)胞分裂有一定規(guī)律，蠶豆一般上午9～10時(shí)、下午14～17時(shí)才處于分裂高峰期，因此本實(shí)驗(yàn)取材時(shí)間設(shè)定為上午9～10時(shí)，以便可以觀察到更多分裂期的細(xì)胞.

2　結(jié)果與分析

2.1　氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子發(fā)芽率的影響

表1顯示了不同濃度氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子發(fā)芽率的影響.隨著處理天數(shù)的增加，對(duì)照組及氯化銅脅迫組發(fā)芽率均呈增加趨勢(shì)，但氯化銅脅迫組發(fā)芽率基本上總低于對(duì)照組發(fā)芽率；相同處理天數(shù)下，氯化銅處理濃度越高，發(fā)芽率越低.這說(shuō)明氯化銅對(duì)蠶豆種子的萌發(fā)有抑制作用，氯化銅處理濃度越高，抑制程度越強(qiáng).

表1　不同濃度氯化銅脅迫下蠶豆種子發(fā)芽率/%

2.2　氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子根長(zhǎng)的影響

表2　不同濃度氯化銅脅迫下蠶豆種子根長(zhǎng)/cm

不同濃度氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子根長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知，同一濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論對(duì)照組還是脅迫組均呈增加趨勢(shì)，但對(duì)照組根長(zhǎng)增加幅度相對(duì)較大.相同處理天數(shù)下，氯化銅處理濃度與根長(zhǎng)成反比，即氯化銅濃度越高，根生長(zhǎng)越慢.從表2還可以看出，低濃度(≤10 mg/L)氯化銅脅迫1 d和2 d時(shí)，蠶豆根生長(zhǎng)速度要快于對(duì)照，但脅迫3 d和4 d后，蠶豆根生長(zhǎng)速度與對(duì)照比較明顯減慢，并且氯化銅濃度越高，根長(zhǎng)增加幅度越小.以上分析說(shuō)明低濃度氯化銅處理短時(shí)間內(nèi)有利于蠶豆根的生長(zhǎng)，但隨著處理天數(shù)延長(zhǎng)，其作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，會(huì)抑制蠶豆根的生長(zhǎng)，而高濃度氯化銅處理會(huì)抑制甚至阻礙蠶豆根的生長(zhǎng).

2.3　氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子芽長(zhǎng)的影響

不同濃度的氯化銅脅迫對(duì)蠶豆種子芽長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表3.如表3所示，隨著處理天數(shù)延長(zhǎng)，對(duì)照組及氯化銅脅迫組芽長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)，但對(duì)照組增長(zhǎng)速度及增長(zhǎng)幅度明顯大于氯化銅脅迫組.同樣處理天數(shù)下，氯化銅處理濃度與芽長(zhǎng)成反比.從表3還可以看出，較高濃度(≥40 mg/L)的氯化銅處理下，第3 d才長(zhǎng)芽.這說(shuō)明重金屬銅會(huì)抑制蠶豆出芽，并且銅離子濃度越大，對(duì)蠶豆的出芽抑制作用越強(qiáng).

表3　不同濃度氯化銅脅迫下蠶豆種子芽長(zhǎng)/cm

2.4　氯化銅脅迫對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體的影響

不同濃度氯化銅脅迫對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響見(jiàn)表4.如表4所示，無(wú)論取材部位是主根根尖還是側(cè)根根尖，其根尖細(xì)胞染色體畸變率均隨著氯化銅濃度的增大而增加，表4還顯示，在氯化銅濃度較小時(shí)(<40 mg/L)，染色體畸變率變化不大，而氯化銅濃度較高時(shí)(>40 mg/L)，染色體畸變率增加幅度明顯變大.這說(shuō)明較低濃度的重金屬銅對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體影響不明顯，而較高濃度的重金屬銅對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體影響明顯.

表4　不同濃度氯化銅脅迫下

2.5　氯化銅脅迫對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

不同濃度氯化銅脅迫對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響見(jiàn)表5.從表5可知，無(wú)論取材部位是主根根尖還是側(cè)根根尖，其根尖細(xì)胞微核數(shù)都隨著氯化銅濃度的升高而逐漸增加.無(wú)氯化銅脅迫時(shí)，細(xì)胞微核率為0，高濃度氯化銅脅迫(>40 mg/L)時(shí)，細(xì)胞微核數(shù)增加幅度明顯變大，這說(shuō)明高濃度的重金屬銅對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響較大.

表5　不同濃度氯化銅脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞微核率/‰

3　結(jié)論與討論

3.1　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，同一濃度下，隨著氯化銅脅迫天數(shù)的延長(zhǎng)，蠶豆種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)雖然呈增加趨勢(shì)，但增加幅度明顯小于對(duì)照；相同處理天數(shù)下，氯化銅處理濃度與蠶豆種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)基本成反比，但與蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率及微核率成正比，并且氯化銅處理濃度越高，染色體畸變率及微核率增加幅度越大.綜上所述，不同濃度的氯化銅脅迫處理不同天數(shù)對(duì)蠶豆種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、主根和側(cè)根根尖細(xì)胞染色體及微核均有不同程度地影響.

3.2　討論

重金屬對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用的原因主要是重金屬通過(guò)根部進(jìn)入植物體內(nèi)，擾亂植物的內(nèi)部生長(zhǎng)條件，然后經(jīng)過(guò)一系列生理生化反應(yīng)，來(lái)破壞植物的正常生長(zhǎng).具體表現(xiàn)為隨著重金屬濃度的增加會(huì)使植物的根出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、甚至停止生長(zhǎng).外觀會(huì)表現(xiàn)出葉子卷曲，甚至變黑，沒(méi)有光澤，而且根也會(huì)相繼變黑，甚至爛掉[14-15].本實(shí)驗(yàn)中蠶豆根系及一些葉片性狀均發(fā)生類(lèi)似的變化(見(jiàn)圖1、圖2).

圖1　不同濃度氯化銅脅迫處理前蠶豆側(cè)根生長(zhǎng)情況

圖2　不同濃度氯化銅脅迫處理4 d后蠶豆側(cè)根生長(zhǎng)情況

重金屬不僅影響植物的外觀而且還會(huì)影響植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu).但在自然條件或人工因素的重金屬影響下，染色體會(huì)出現(xiàn)一定程度的變異.具體表現(xiàn)為：一些染色體的數(shù)目成對(duì)的增加或減少，或者是單個(gè)的增加或減少；還有一些染色體會(huì)出現(xiàn)斷裂，然后會(huì)再一次的異常連接；甚至?xí)霈F(xiàn)在一條染色體上某一段會(huì)含兩份或兩份以上；以及還會(huì)出現(xiàn)某一條染色體發(fā)生斷裂，形成的節(jié)段，經(jīng)過(guò)變位重新連接.本研究中，重金屬氯化銅脅迫對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體的影響見(jiàn)圖 3.

重金屬影響細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不僅有染色體畸變還有細(xì)胞微核.細(xì)胞核是真核細(xì)胞內(nèi)最大最重要的細(xì)胞器.細(xì)胞核一旦破壞，細(xì)胞有絲分裂也會(huì)發(fā)生變化，在每個(gè)分裂時(shí)期的染色體會(huì)有不同程度的變化，在染色體畸變的間期會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞微核現(xiàn)象.重金屬導(dǎo)致植物的細(xì)胞核解體常見(jiàn)有2種形式，一種是解體成許多圓球狀小的核，二是核質(zhì)會(huì)逐漸解體消失，最后只余下一個(gè)空網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu).本研究中觀察到的細(xì)胞微核現(xiàn)象見(jiàn)圖4.

圖3　染色體畸變現(xiàn)象

圖4　微核現(xiàn)象

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