沈韌 萬諒 賈艷偉

微流控技術(shù)是一種對微尺度流體（微升到皮升量級）進(jìn)行精確控制和操縱的技術(shù)。近二三十年來，得益于納米制造技術(shù)的成熟與生化技術(shù)對操縱微量液體的需求，微流控技術(shù)取得了飛速的發(fā)展。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，基于微流控平臺的檢測技術(shù)具有節(jié)省樣本與試劑用量，反應(yīng)速度更快，高通量，易便攜，自動化潛力高等優(yōu)勢。1998年Burns等［1］提出的將多種生物、化學(xué)分析功能整合在一張微小芯片上的“芯片實驗室”（lab-on-a-chip，LOC）的概念，展示了微流控技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測、精準(zhǔn)醫(yī)療的美好前景。近年來，開發(fā)“芯片實驗室”，又稱“微型全分析系統(tǒng)”，已經(jīng)發(fā)展為一個物理、微電子、材料、化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉的新型研究領(lǐng)域。本文主要介紹了微流控技術(shù)的分類、原理，以及其在臨床核酸檢測、免疫蛋白檢測、藥物篩查等方面的應(yīng)用，以展示該技術(shù)在臨床檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景及挑戰(zhàn)。

1 微流控的分類及原理

微流控技術(shù)有很多不同的細(xì)分領(lǐng)域?；诒徊倏氐囊后w形態(tài)，微流控技術(shù)可簡單分為連續(xù)流體微流控（continuous-flow microfluidics）和液滴微流控（droplet microfluidics）?；谝后w移動的路徑，微流控技術(shù)可分為通道微流控（channel-based microfluidics）和基于開放平臺的微流控技術(shù)（open platform microfluidics）。

通道微流控通過在玻璃、硅片、高分子聚合物如聚二甲基矽氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）等材料上構(gòu)建微流通道［2-5］，利用閥門、泵等部件控制液體流速。由于PDMS價格便宜、制造方便、透明、具有較高的生物相容性，基于PDMS的微流控芯片獲得了廣泛的應(yīng)用。

基于開放平臺的微流控技術(shù)使得被操控的液滴不限于在通道中流動，比如基于電潤濕現(xiàn)象［6］（electrowetting on dielectric，EWOD）開發(fā)的數(shù)字微流控技術(shù)（digital microfluidics，DMF）［7］。液體在介電表面的電潤濕現(xiàn)象是指當(dāng)液滴位于鍍有一層疏水性介電層的平面電極陣列之上，對電極通電時，液滴與通電電極接觸位置的接觸角會變小，從而促使液滴移動。因此可以通過電路控制來操控微升到皮升量級的離散液滴進(jìn)行移動、融合、分裂等動作。此外，除了加以電場驅(qū)動液滴［8-10］，還有利用光敏材料的光驅(qū)動型［11］、利用壓電材料的力驅(qū)動型［12］和表面聲波驅(qū)動型［13］等數(shù)字微流控技術(shù)。與傳統(tǒng)的管道式微流技術(shù)相比，數(shù)字微流控技術(shù)無需泵、閥門等外接部件即可對離散液滴進(jìn)行獨立控制，也更容易與溫控系統(tǒng)整合，更具有集成化、自動化的潛力。

此外，紙質(zhì)微流控［14］也屬于基于開放平臺的微流控技術(shù)，其原理是通過在紙基質(zhì)上構(gòu)建親水通道來驅(qū)動液滴被動移動。由于紙基質(zhì)成本與其它基質(zhì)相比大為降低，紙質(zhì)微流控技術(shù)也吸引了眾多研究者的目光［7，15］。

2 微流控在臨床檢測領(lǐng)域的應(yīng)用及進(jìn)展

微流控技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了臨床檢測領(lǐng)域“即時檢驗”（point-of-care testing，POCT）［16］概念的誕生與發(fā)展。“即時檢驗”是指在照顧病人的當(dāng)下即可使用的醫(yī)學(xué)檢測方法，其檢測設(shè)備需要具有便攜性、操作簡單、檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可由非專業(yè)檢驗人員甚至病人自己操作，可極大減輕專業(yè)醫(yī)學(xué)檢測人員的負(fù)擔(dān)。目前微流控技術(shù)已在臨床檢測的多個方面如核酸檢測、免疫測定、耐藥性檢測等獲得應(yīng)用。

2.1 在核酸檢測中的應(yīng)用

在對臨床樣本中的DNA或RNA進(jìn)行分析之前，需要先將核酸分子從原始樣本中提取、純化。微流控芯片中最常用的核酸提純方法是磁珠法［17］。Sista等人［18］在數(shù)字微流控芯片上利用磁珠法從人全血樣本中成功提純?nèi)嘶蚪MDNA，并用于后續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。在該系統(tǒng)中，血液樣本在芯片上相繼與裂解液、DNA捕獲磁珠、清洗液、洗脫液結(jié)合。通過激活電極移動液滴，配合位于芯片底部的磁力裝置，可實現(xiàn)不同液滴與磁珠的結(jié)合與分離，從而完成DNA提純過程。許多微流控芯片在提取核酸時，會通過加熱來加速細(xì)胞裂解［19-20］。鑒于對核酸進(jìn)行后續(xù)分析通常需要控溫裝置，這種設(shè)計在不增加設(shè)備復(fù)雜度的同時可以提高核酸提取的效率。除了磁珠法、加熱法等方法，一些微流控芯片利用介電泳效應(yīng)（dielectrophoresis trapping）［21］、等速電泳分離［22］等微流控領(lǐng)域獨有的技術(shù)來完成核酸分子的提純。此外，為了滿足第二代測序技術(shù)對于更高純度核酸樣本的需求，Choi等人［23］利用慣性聚焦技術(shù)（inertial focusing），使全血、血漿樣本中的巨細(xì)胞病毒顆粒在通過螺旋形的微流通道后與血細(xì)胞分離，降低了樣本中人類基因的比例，減少了后續(xù)測序的背景噪音。

作為一種高特異性、高靈敏度、反應(yīng)快速的核酸擴(kuò)增手段，PCR在微流控領(lǐng)域的應(yīng)用也得以充分開發(fā)。精確的溫度控制系統(tǒng)是完成PCR的基本條件。基于溫控的實現(xiàn)方法，可以簡單地將微流控芯片上的PCR方法分為2類：靜止PCR和動態(tài)PCR。在靜止PCR方法中，反應(yīng)液在PCR過程中位置不變，通過對固定反應(yīng)點的升降溫來實現(xiàn)熱循環(huán)。如Chang等人［24］利用金屬鉑作為加熱元件和感溫元件對固定的PCR反應(yīng)位點進(jìn)行溫控，成功在數(shù)字微流控芯片上擴(kuò)增出二型登革病毒核酸。在動態(tài)PCR方法中，反應(yīng)液在幾個具有特定溫度的恒溫域之間受控地來回移動，以此實現(xiàn)反應(yīng)液的熱循環(huán)。Sista等人［18］開發(fā)的用于PCR的微流控芯片具有一個60℃恒溫域和一個95℃恒溫域，反應(yīng)液在2個恒溫域之間移動，18 min即可完成40個循環(huán)的PCR反應(yīng)。PCR與微流控技術(shù)的結(jié)合還突破了傳統(tǒng)PCR方法反應(yīng)速度的極限。對于液滴微流控來說，微小液滴具有的高表面積與體積比使得熱量傳導(dǎo)更快、更均一，可極大加速PCR反應(yīng)進(jìn)程。Wheeler等人［25］從反應(yīng)熱動力學(xué)、DNA聚合酶等角度探索了在微流控芯片上進(jìn)行超快速PCR的極限，利用適合于進(jìn)行快速PCR的SpeedSTARTMHS DNA聚合酶或KAPA2G DNA聚合酶，并減少在變性、退火、延伸各步驟的停留時間，在3 min以內(nèi)完成了35個循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。陳天藍(lán)等人［26］設(shè)計的數(shù)字微流控芯片用鉻電極作為溫控系統(tǒng)，可以使液滴超快速升降溫，在7 s之內(nèi)完成對SYBR和特異性分子信標(biāo)探針的溶解曲線分析。與傳統(tǒng)的PCR設(shè)備相比，不喪失靈敏度的前提下，在大部分微流控芯片上進(jìn)行PCR可以至少減少50%的反應(yīng)時間和70%的樣本消耗［7］。

除了與PCR技術(shù)結(jié)合，各種基于微流控芯片的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)也得以開發(fā)。雖然在靈敏度和特異性方面與PCR有差別，但由于等溫擴(kuò)增技術(shù)對溫度的精準(zhǔn)控制要求較低，開發(fā)者更容易將相應(yīng)設(shè)備小型化、便攜化。萬諒等人［27］開發(fā)的便攜式微流控設(shè)備，可在不到一個鞋盒大小的數(shù)字微流控平臺上實現(xiàn)對布魯氏菌基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及檢測。在67℃40 min的擴(kuò)增反應(yīng)之后，通過對分子信標(biāo)探針的熔解曲線分析，不到5 min即可完成對目的基因的檢測。Laili等人［28］開發(fā)的微流控核酸檢測芯片則結(jié)合了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle replication，RCA）和微流電泳技術(shù)，在37℃60 min的RCA擴(kuò)增反應(yīng)后，可通過在微流通道中進(jìn)行電泳分離來檢測樣本中是否含有霍亂弧菌的目的基因。

鑒于微流控領(lǐng)域反應(yīng)液的微小體積，更需要高靈敏度的檢測方法來檢測樣本中的核酸分子。目前微流控芯片上開發(fā)的實時PCR方法最常用的是熒光檢測法［29］，通過SYBR等非特異性嵌入式染料或者Taqman探針、分子信標(biāo)探針等特異性熒光探針來檢測目的基因。小型發(fā)光二極管可被整合到微流控系統(tǒng)中，代替較大的汞燈、水銀燈等作為激發(fā)光源。除了實時PCR，研究者們在各種微流控平臺上整合了核酸雜交技術(shù)［13］、毛細(xì)管電泳技術(shù)［30］、焦磷酸測序技術(shù)［31］、DNA光學(xué)圖譜技術(shù)［32］等核酸分析方法，作為核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)檢測分析方法。

2.2 在免疫分析中的應(yīng)用

基于抗原抗體之間特異性結(jié)合的免疫分析法是臨床診斷領(lǐng)域最常用的檢測方法之一。傳統(tǒng)的免疫分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），具有成本低，易操作的優(yōu)點，但耗時長、費人力、需要額外設(shè)備如酶標(biāo)儀等特性也阻礙了其應(yīng)用于即時檢測。基于微流控平臺的免疫分析方法［33-34］，可以促進(jìn)抗原抗體之間的吸附，減少反應(yīng)時間，實現(xiàn)自動控制，整合小型光學(xué)探頭使設(shè)備小型化，實現(xiàn)即時檢測的目標(biāo)。

誘餌抗原（或抗體）的包被、液相的轉(zhuǎn)移和反應(yīng)信號的捕捉是酶免分析試驗最基本的3個方面。

誘餌抗原（或抗體）的包被對酶免試驗的靈敏度和特異性有著極大影響。平面介質(zhì)（如PDMS、玻璃等）、磁珠和非磁性微球是微流控領(lǐng)域3類最常用的包被介質(zhì)。Kevin等人［35］將蛋白質(zhì)的包被整合到PDMS聚合過程中，由于該方法簡單易行并具有較高包被效率，在PDMS微流芯片的應(yīng)用具有很大潛力。

在通道型微流控芯片中，液相轉(zhuǎn)移常通過操縱泵和閥門來完成，也可以利用離心力等方法完成。Wang等人［36］通過微型氣動泵和微型氣動閥，完成了在PDMS芯片上對丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體的酶免檢測。Lai等人［37］基于微離心力開發(fā)的酶免分析芯片，可將酶免試驗整合到一張普通光碟大小的微流設(shè)備中。在數(shù)字微流控芯片中，液相的更換通常由電極驅(qū)動液體移動配合著磁力裝置完成。Wheeler等人［38］設(shè)計的數(shù)字微流控芯片中，位于芯片底部的磁力裝置用于固定或移動包被了風(fēng)疹病毒表面抗原的磁珠，驅(qū)動電極來控制樣本、酶標(biāo)記物、顯色液等不同液滴與磁珠融合、分離，可同時完成風(fēng)疹病毒IgM和IgG的自動化檢測。

傳統(tǒng)實驗室進(jìn)行的酶免分析方法中，通常使用酶標(biāo)儀測吸光度來確認(rèn)反應(yīng)結(jié)果。而微流控設(shè)備多數(shù)選擇用熒光信號來檢測芯片上酶免反應(yīng)的結(jié)果。相比于吸光度，熒光信號靈敏度和特異性都更高，且將現(xiàn)有的熒光標(biāo)記系統(tǒng)用于微流控芯片上可實現(xiàn)多重檢測。Tohid等人［39］設(shè)計的PDMS微流芯片可以在單一通道完成對五種抗體的多重檢測。除了光學(xué)信號，電化學(xué)信號也常應(yīng)用于微流控芯片上去檢測酶免反應(yīng)結(jié)果［40-42］，通過檢測被免疫反應(yīng)改變的電勢、電流、電壓、電容、電阻等因素，可以獲得定量結(jié)果。與光學(xué)信號相比，電化學(xué)信號不需要額外的激發(fā)光源，更容易被整合到小型化的微流控系統(tǒng)中，而且電化學(xué)信號的檢測靈敏度不受光程、液體濁度等因素的影響，用于微流控系統(tǒng)有著天然的優(yōu)勢。

2.3 在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

開發(fā)能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、分選、分析的微流控芯片也是微流控領(lǐng)域的一大研究熱點。微流控技術(shù)小型化、高通量的特點使得其具有利用珍貴稀少的組織細(xì)胞樣本進(jìn)行高通量分析的潛力，為精準(zhǔn)醫(yī)療、個性化醫(yī)療提供支持［43］。Irena等人［44］驗證了在數(shù)字微流控芯片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、藥物細(xì)胞毒性分析實驗的可行性。該實驗中，普朗尼克F68作為添加劑被加入液滴中，以減少芯片表面對細(xì)胞及蛋白質(zhì)的吸附，從而降低驅(qū)動液滴所需的電壓，以免對細(xì)胞造成傷害。Ada等人［45］研發(fā)的PDMS微流控芯片利用特殊設(shè)計的微流通道生成含單細(xì)胞的液滴，可以在2.4 cm×2.4 cm大小的芯片上實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞系以及原生腫瘤組織細(xì)胞的藥物篩查。

基于微流控芯片的3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也是近年來微流控技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一類發(fā)展方向。與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，3D環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)能更好地模擬體內(nèi)真實的細(xì)胞生長環(huán)境、反應(yīng)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用。Yu等人［46］設(shè)計的PDMS芯片中，多個平行的細(xì)胞培養(yǎng)腔與微小通道交聯(lián)，模擬了體內(nèi)組織與毛細(xì)血管網(wǎng)之間的相互作用。Raty等人［47］的實驗結(jié)果證明小鼠胚胎細(xì)胞在微流通道中的生長速度比傳統(tǒng)平板培養(yǎng)更接近體內(nèi)真實生長速率。而Yeong等人［48］將PDMS形成的特殊結(jié)構(gòu)與多孔細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合，灌注水凝膠形成多個平行的3D細(xì)胞培養(yǎng)腔體，構(gòu)建了一個與傳統(tǒng)細(xì)胞分析、藥物篩選等實驗方法完全兼容的、高通量的3D細(xì)胞培養(yǎng)微流控平臺。

除了基于細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片，能代替大型流式細(xì)胞設(shè)備的微型細(xì)胞分選芯片也是一個研究焦點。除了通過熒光標(biāo)記、大小等因素進(jìn)行分選，微流控芯片還可以通過介電泳效應(yīng)對細(xì)胞進(jìn)行分選。在非均勻電場中，不同極性的細(xì)胞會朝著不同電場強(qiáng)度的地方遷移，利用介電泳效應(yīng)和經(jīng)特殊設(shè)計的微流通道，Takahashi等人［49］完成了高通量細(xì)胞分選。此外，慣性微流體技術(shù)也常被應(yīng)用于細(xì)胞分選。Kwon等人［50］利用螺旋形的微流通道，使得死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等在通過微流控芯片后從細(xì)胞培養(yǎng)液中析出，可進(jìn)一步應(yīng)用于灌注式細(xì)胞培養(yǎng)。Abdulla等人［51］設(shè)計的多個微流通道級聯(lián)的微流控芯片無需對細(xì)胞進(jìn)行任何標(biāo)記就可以將循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）從稀釋的全血樣本中分離，且分離出的CTC保持高存活率，便于進(jìn)行后續(xù)藥物篩查等試驗。

3 展望

近年來，微流控技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用研究極大促進(jìn)了現(xiàn)場、即時檢測和精準(zhǔn)、個性化醫(yī)療的發(fā)展。盡管現(xiàn)時微流控技術(shù)的全面推廣還受限于制備過程中的復(fù)雜操作、芯片對生化成分的吸附等一系列問題，但隨著新材料、新技術(shù)、新發(fā)現(xiàn)的不斷涌出，有著來自各個學(xué)科的研究人員對微流控技術(shù)持續(xù)的研究與改善，微流控技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域乃至基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的巨大潛能毋庸置疑。微流控技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化也將推動臨床檢測方法朝著小型化、快速化、高通量、便攜性、自動化的方向發(fā)展，“芯片實驗室”的廣泛應(yīng)用指日可待。