趙寧 陳雙林

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

竹黃（Shiraia bambusicolaHenn.）是子囊菌門的單種屬真菌。通常寄生于竹子的嫩枝上，是我國民間傳統(tǒng)的藥用資源［1］。竹黃的主要活性代謝產(chǎn)物是屬于苝醌類化合物的竹紅菌素（Hypocrellins），分為竹紅菌甲素（Hypocrellin A，HA）、竹紅菌乙素（Hypocrellin B，HB）、竹紅菌丙素（Hypocrellin C，HC）和竹紅菌丁素（Hypocrellin D，HD）［2-3］。竹紅菌素具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、利尿和護心血管的作用，作為光敏藥物在臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、燒傷、皮膚病等疾病，在預(yù)防和治療癌癥、心血管疾病等方面也具有巨大的藥用潛力［4］。不同產(chǎn)地的竹黃在竹紅菌素的產(chǎn)量上可能存在差異，趙丹和梁宗琦［5］就指出，來自江蘇、浙江和四川的竹黃分離體，不論是在培養(yǎng)性狀上還是產(chǎn)生竹紅菌素及苝醌類色素上都存在差異。而竹黃的寄主有剛竹屬Phyllostachys、箣竹屬Bambusa、箭竹屬Fargesia、大節(jié)竹屬Indosasa、苦竹屬Pleioblastus和短穗竹屬Brachystachyum等竹種［6-7］，來源于不同竹種寄主植物上的竹黃更可能存在竹紅菌素的合成代謝差異，掌握竹黃的遺傳多樣性是研究竹紅菌素的生物合成途徑與產(chǎn)量差異的根本，也有助于選育高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株。本文綜述了竹黃的遺傳多樣性、竹紅菌素對癌細胞的作用和竹紅菌素生物合成諸方面的研究進展，旨在為竹黃種質(zhì)資源保育提供理論依據(jù)，為深入研究竹紅菌素的生物合成途徑，竹紅菌素及其衍生物、修飾物等對腫瘤細胞的作用和藥物研發(fā)提供重要參考。

1 竹黃的遺傳多樣性

遺傳多樣性（Genetic diversity）是生物多樣性的核心和基礎(chǔ)。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的各種遺傳信息的總和；狹義的遺傳多樣性專指種內(nèi)基因的變化，包括一個物種內(nèi)不同種群間和同一種群內(nèi)的遺傳變異［8］。遺傳多樣性是研究物種起源與演化的依據(jù)，能夠揭示遺傳物質(zhì)的變異與遺傳結(jié)構(gòu)。因此，全面了解竹黃Shiraia bambusicola的生物學(xué)性狀和遺傳多樣性，對于竹黃的起源演化、分布格局、種質(zhì)資源保護、菌種繁育乃至人工栽培等研究具有重要意義。

DNA分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳變異的直接反映［9］，已廣泛應(yīng)用于真菌的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和雜交育種等方面。經(jīng)過約40年的發(fā)展，用于真菌遺傳多樣性研究的DNA分子標記已有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機引物擴增多態(tài)性（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、內(nèi)部簡單重復(fù)序列（ISSR）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）等［10-13］。

為應(yīng)用RAPD分子標記研究不同地理居群竹黃S. bambusicola的遺傳多樣性，范英等［14］用SDS法提取了竹黃基因組DNA，對影響RAPD反應(yīng)的各因素進行了優(yōu)化，最終建立了穩(wěn)定的竹黃基因組的RAPD分子標記體系，可獲得良好的竹黃RAPD指紋圖譜。最佳的竹黃RAPD分子標記體系為：2.5 μL 10×PCR緩沖液、1.0 U Taq酶、2 mmol /L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L隨機引物、50 ng DNA模板以及40次循環(huán)。隨后，范英等［15］采用這一分子標記體系對江蘇、安徽、浙江三省的8個竹黃居群進行基于RAPD的遺傳多樣性研究，利用篩選出的5個隨機引物共擴增出77個位點，片段長度在250-200 bp之間，平均每個引物產(chǎn)生15.4個位點，其中52個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性比率達67.53%，因此RAPD分析可為竹黃的群體遺傳研究提供豐富的DNA分子多態(tài)性標記。通過UPGMA聚類分析，8個居群被劃為3個分支，并表現(xiàn)出一定的地域性，說明各居群的親緣關(guān)系與地理分布密切相關(guān)。Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon多態(tài)性信息指數(shù)均表明竹黃物種水平的遺傳多樣性高于居群水平［15］，即竹黃遺傳多樣性主要來源于居群間的差異，居群內(nèi)差異的貢獻相對較低，表明造成竹黃遺傳變異的主要原因是居群之間的差異。陳藝萌［16］利用AFLP分子標記技術(shù)對安徽、浙江、貴州等不同來源的28份竹黃樣本進行遺傳多樣性分析，通過單因素分析確定并優(yōu)化了竹黃AFLP-PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×Taq buffer（with Mg2+）、0.7 μL Taq 聚合酶（2.5 U/μL）、0.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、各 1.5 μL 的引物組合（10 mmol/L）、2.5 μL 稀釋20倍的預(yù)擴增產(chǎn)物以及15.8 μL dd H2O。AFLP研究表明竹黃標本在DNA水平上具有較少的酶切位點，但位點差異性較高，具有較豐富的遺傳多樣性；聚類分析表明，竹黃種群間的遺傳變異主要來源于不同種群間，即地理隔離是導(dǎo)致遺傳變異的主要原因，而種群內(nèi)貢獻較低，遺傳多樣性較低［16］。Qi等［17］對江蘇、安徽、浙江三省的8個竹黃自然居群的107個樣品的基因組DNA進行ISSR-PCR擴增，利用選取的11個引物共擴增出241個ISSR位點，其中240個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性位點高達99.59%，說明竹黃物種水平上的遺傳多樣性非常豐富，且ISSR可為竹黃的群體遺傳研究提供豐富的DNA分子多態(tài)性標記，Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon多態(tài)性信息指數(shù)說明居群的遺傳分化程度極大。AMOVA分析結(jié)果表明在總遺傳變異中，居群內(nèi)變異占60.04%，居群間變異占39.96%，這說明竹黃遺傳多樣性主要來源于居群內(nèi)，居群間貢獻較小，即竹黃的遺傳變異主要是由居群內(nèi)的變異造成的［17］，與范英等［15］和陳藝萌等［16］的研究結(jié)果不同。因此，為了澄清竹黃居群內(nèi)和居群間的遺傳變異何者具有更高的水平，盡可能廣泛地采用全國竹黃分布地的材料、使用有效的分子標記技術(shù)應(yīng)是竹黃遺傳多樣性今后研究的重要工作。

由于遺傳多樣性及寄主竹種類的不同，不同居群間竹黃S. bambusicola的生理活性成分和合成代謝途徑就可能存在差異，這對竹黃的天然產(chǎn)物和藥理作用的進一步開發(fā)利用具有重要價值。就遺傳學(xué)角度而言，一個物種遺傳多樣性的高低與其生存能力、適應(yīng)能力和進化潛力密切相關(guān)，豐富的遺傳多樣性意味著較高的生存適應(yīng)和進化潛力、較大的育種及遺傳改良潛力［18］。因此，有效保護竹黃野生菌種資源及遺傳多樣性，對于今后竹黃的天然產(chǎn)物和藥物活性開發(fā)以及菌種遺傳改良等都具有重要意義。

2 竹紅菌素對癌細胞的作用

在竹紅菌素諸多藥理活性中，抗癌活性尤其引人矚目，竹紅菌素及其衍生物可以抑制多種癌細胞。傅乃武和安靜儀認為HA可以破壞肝癌細胞的線粒體和微粒體的結(jié)構(gòu)和功能，從而起到抗癌的作用［19］。Hirayama等［20］對HA抗病毒活性機制進行研究，推斷HA可能與包膜病毒的包膜結(jié)合，產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以使包膜病毒滅活。Zhang等［21］證實HA可以誘導(dǎo)人宮頸癌細胞HeLa、人腸道癌細胞HIC和人胃癌細胞MGC-803的細胞形態(tài)發(fā)生變化，影響線粒體脫氫酶活性，導(dǎo)致DNA片段化，證明HA可以誘導(dǎo)細胞凋亡，活性氧自由基在誘導(dǎo)癌細胞程序性死亡中起到重要作用。Hudson等［22］報道HA和金絲桃素在抗HIV-Ⅰ中具有同種作用。王志津等［23］構(gòu)建了HA的脂質(zhì)體，證明HA脂質(zhì)體對培養(yǎng)中的HeLa細胞具有明顯的光動力滅活作用。

盡管竹紅菌素展示出了對于癌細胞的良好活性，但是，天然竹紅菌素是一類混合的親脂性化合物，水溶性差，不便于制成藥物制劑，尤其是靜脈注射劑；竹紅菌素在常規(guī)光療窗口（600-900 nm）幾乎無吸收，無法作為用于光動力治療（Photodynamic therapy，PDT）的有效光敏色素藥物；竹紅菌素在光照條件下結(jié)構(gòu)和活性還會發(fā)生改變；與竹紅菌素相關(guān)的藥代動力學(xué)過程以前沒有研究，這些情況都限制了竹紅菌素在臨床中的應(yīng)用［24］。為了獲得在光療窗口有強吸收和脂水兼容的光療藥物，需對竹紅菌素結(jié)構(gòu)進行修飾和改造。目前主要有兩種途徑，一是在天然竹紅菌素的基礎(chǔ)上修飾合成一系列竹紅菌素衍生物，可以改變它們產(chǎn)生單重態(tài)氧和其他活性氧的能力，以期獲得更有應(yīng)用前景的光療藥物［25-26］。二是在對竹紅菌素進行化學(xué)修飾的同時，研究者們嘗試采用物理包埋方法對竹紅菌素進行修飾，即在助溶劑和分散劑存在的條件下用載體對竹紅菌素進行包封，制得被包裹在載體內(nèi)部的竹紅菌素納米粒子，以此提高竹紅菌素的水分散性和光療效率［27-29］。

2.1 天然竹紅菌素的抗腫瘤活性

Cao等［30］發(fā)現(xiàn)HA在可見光下可使小鼠肉瘤細胞S-180活力下降和氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂、鳥嘌呤的選擇性破壞以及一些堿基堆積力的破壞和氫鍵的斷裂。王家珍等［31］研究表明光誘導(dǎo)下的HA能在體外引起人宮頸癌細胞HeLa的細胞膜和細胞骨架損傷，將細胞周期部分阻斷于S期，從而抑制癌細胞的增殖。Ali等［32］研究證明光誘導(dǎo)下的HA可以引起低分化的人鼻咽癌細胞CNE-2等3種人類粘膜癌細胞發(fā)生凋亡。Deininger等［33］觀察到光動力處理下HA和HB作用的內(nèi)皮細胞SVHCEC、巨噬細胞U937和膠質(zhì)瘤細胞LN229中促血管發(fā)生的血管內(nèi)皮生長因子VEGF、抗血管生成sFlt-1、血管抑素P43、同種異體移植炎癥因子和結(jié)締組織生長因子含量的升高。因此認為在PDT驅(qū)動下竹紅菌素除了在腫瘤細胞中誘導(dǎo)細胞死亡，還能通過促進內(nèi)皮細胞死亡以形成血栓的方式來切斷腫瘤組織的營養(yǎng)供給，從而抑制腫瘤生長。陳潔等［34］采用結(jié)晶紫染色、流式細胞術(shù)和RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HA可以誘導(dǎo)人黑色素腫瘤細胞A375-S2凋亡，并使細胞周期停滯在S期，同時誘導(dǎo)細胞周期蛋白CylinB1的mRNA表達量增加。尚立群等［35］就HB和血卟啉衍生物光動力療法對人食管癌細胞的殺傷效應(yīng)進行了研究，分別以不同濃度的HB及血卟啉衍生物（HpD）孵育細胞并進行光照處理，結(jié)果表明HB對食管癌細胞株的殺傷效應(yīng)明顯高于血卟啉衍生物，作用劑量更低，是一種能高效殺傷腫瘤細胞的新一代光敏劑。HB還對人肺癌細胞系A(chǔ)549及經(jīng)順鉑誘導(dǎo)耐藥的多藥耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP具有殺傷作用，并且對后者的殺傷效果明顯優(yōu)于已產(chǎn)生了耐藥效應(yīng)的化療藥物，由此推斷HB光動力療法以后可能成為治療順鉑耐藥腫瘤的有效手段［36］。黃乃艷等［37］對小鼠體內(nèi)抑瘤的研究結(jié)果表明，HB對小鼠肉瘤細胞S-180具有光動力損傷作用，再次證明HB是一種能夠用于腫瘤PDT的具有開發(fā)潛力的光敏劑。

2.2 化學(xué)修飾竹紅菌素的抗腫瘤活性

Estey等［38］研究了HA和HB及其衍生物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明HB及其鎂合物、胱胺竹紅菌乙素、丁胺竹紅菌乙素、乙醇胺竹紅菌乙素等能顯著抑制鼠源瘤細胞EMT6/Ed的增殖。Xu等［39］報道了HA的衍生物2-丁胺-2-脫甲氧-竹紅菌甲素（2-BA-2-DMHA）和HB的衍生物2-丁胺-2-脫甲氧-竹紅菌乙素（2-BA-2-DMHB）在產(chǎn)生單線態(tài)氧及超氧陰離子自由基方面都強于各自的母體化合物，能夠顯著抑制癌細胞HeLa、MGC803和Capan-1的增殖，腫瘤移植試驗表明，2-BA-2-DMHA在體內(nèi)具有顯著的抗癌活性。Yang等［40］分別用攜帶野生型p53基因cDNA和反義bcl-2序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)胃腺癌細胞系MGC803，然后加入光敏劑2-BA-2-DMHA并進行紅光照射，檢測細胞存活及凋亡情況發(fā)現(xiàn)，在光敏劑及紅光的存在下，野生型p53基因和反義bcl-2都能使轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的存活率降低及促進凋亡，推測該光敏劑的光動力治療途徑可能主要以誘導(dǎo)細胞凋亡為主。Zhou等［41］發(fā)現(xiàn)在2-BA-2-DMHA的光動力學(xué)作用下，胃癌細胞MGC803細胞質(zhì)中的游離鈣離子濃度上升，并且導(dǎo)致細胞死亡，且與光敏劑劑量、光強度及細胞外鈣離子濃度成正比。劉子文［42］選用在光療窗口有較強吸收的竹紅菌素三種衍生物正丁胺竹紅菌甲素、正丁胺竹紅菌乙素和環(huán)己胺竹紅菌乙素，進行細胞殺傷實驗，結(jié)果表明隨著光敏劑濃度和光照劑量的增加，三種衍生物對人胰腺癌細胞Capan-1殺傷的效果也逐漸增加，呈現(xiàn)正態(tài)分布，竹紅菌素胺基衍生物具有良好的光敏作用，其光動力作用適合于治療胰腺癌。劉子文等［43］還研究了2-丁胺-2-去甲氧基竹紅菌乙素（BAHB）誘導(dǎo)人胰腺癌細胞Capan-1的凋亡，BAHB低濃度時主要定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高濃度時定位于溶酶體，研究結(jié)果展示出竹紅菌素衍生物具有良好的攝取動力學(xué)特性，主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡的方式來殺傷細胞，并與線粒體的光敏損傷有關(guān)。

2.3 物理修飾竹紅菌素的抗腫瘤活性

天然竹紅菌素結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾雖然在一定程度上提高了其水溶性或在紅光部分的吸收，但總體來看，化學(xué)修飾的難點在于產(chǎn)物產(chǎn)量低、難純化且難保證竹紅菌素的光敏活性。近年來研究者們嘗試對竹紅菌素進行物理包埋研究，以改善竹紅菌素的光動力效應(yīng)。

Zhou等［44］使用再沉淀法制備了竹紅菌素A納米粒。與未改性的光敏劑相比，竹紅菌甲素納米粒不僅具有優(yōu)良的水溶性，較高的水和光穩(wěn)定性，而且具有較高的單線態(tài)氧產(chǎn)量和DNA光解能力。Gao等［45］將脂質(zhì)包被的竹紅菌素金納米粒應(yīng)用于體外雙光子光熱/光動力學(xué)癌癥治療，構(gòu)建了新的生物共軛納米結(jié)構(gòu)。掃描電鏡和透射電鏡圖像顯示，所制備的前體和生物共軛納米結(jié)構(gòu)具有緊密分散且均一的形態(tài)；能量色散X射線分析和紫外可見光譜表明，這一生物共軛納米結(jié)構(gòu)組裝成功，并在近紅外區(qū)域有強烈的吸收；熒光和電子自旋共振結(jié)果表明，生物共軛納米結(jié)構(gòu)中的金納米粒能夠顯著地淬滅光敏劑并且抑制單線態(tài)氧的產(chǎn)生。進一步實驗證明，由于納米復(fù)合物被癌細胞內(nèi)化，在雙光子照射下，光熱效應(yīng)顯著增強了光動力治療癌癥的效果［45］。Jin等［46］開發(fā)了一種新型多功能納米平臺，結(jié)合近紅外光激發(fā)后伴隨藍光發(fā)射驅(qū)動的上轉(zhuǎn)換納米粒與藍光激發(fā)的光敏劑HA，應(yīng)用于癌癥的PDT治療。制備吐溫20包被的NaYbF4：Tm，Gd @ NaGdF4UCNPs（Tween 20-UCNPs）具有強的藍色上轉(zhuǎn)換發(fā)光和良好的水分散性，可以用作光敏劑載體；藍色發(fā)光帶與HA的有效吸收帶相匹配，從而促進共振能量從上轉(zhuǎn)換納米粒轉(zhuǎn)移到HA，然后激活HA產(chǎn)生單線態(tài)氧。體外研究表明Tween 20-UCNPs @ HA復(fù)合物在980 nm近紅外光激發(fā)下能有效地產(chǎn)生單線態(tài)氧，殺死癌細胞［46］。Qi等［47］采用水包油（O/W）乳液溶劑揮發(fā)法，將HA包封入聚乳酸羥基乙酸（PLGA）中制備獲得了粒徑在20～200 nm之間、表面電荷為-5.8 mV的水分散HA納米顆粒，X射線衍射光譜、紅外光譜和差示熱分析證實HA被成功包裹入PLGA中，光漂白實驗證明PLGA的包裹使HA光穩(wěn)定性增加。體外實驗證明該納米粒不僅能被人肺癌細胞A549攝取并累積在細胞質(zhì)中，而且保持了高光毒性，同時可以誘導(dǎo)A549細胞凋亡，進一步實驗表明，這種光毒性與ROS水平有關(guān)［47］。Lin等［48］合成了一個靶向藥物遞送系統(tǒng)——轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的竹紅菌甲素聚乳酸-羥基乙酸/羧甲基殼聚糖納米粒（TF-HA-CMC-PLGA NPs），并使用掃描電子顯微鏡、動態(tài)光散色、傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜分析方法對納米粒的理化性質(zhì)進行表征。在體外實驗中，TF-HA-CMC-PLGA NPs表現(xiàn)出較弱的細胞暗毒性，顯著的細胞光毒性，產(chǎn)生了較強的活性氧以及引起癌細胞的凋亡。通過A549細胞（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體陽性）的雄性裸鼠荷瘤模型對TF-HACMC-PLGA NPs的體內(nèi)光動力抗腫瘤效率進行評估，結(jié)果證明該納米粒能夠造成腫瘤生長遲緩，治療15 d時腫瘤抑制率高達63%，同時腫瘤組織出現(xiàn)大量細胞凋亡，而對正常組織只有輕微副作用［48］。

2.4 竹紅菌素的藥代動力學(xué)

藥代動力學(xué)（Pharmacokinetics）用于定量研究藥物及其他外源性物質(zhì)在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、消除和排泄的動態(tài)變化規(guī)律及其時量——時效關(guān)系，在藥物研發(fā)、藥品的質(zhì)量控制及指導(dǎo)臨床合理用藥等方面具有重大的理論和實用價值。藥物被攝入體內(nèi)后經(jīng)吸收進入血液，隨血流透過生物膜進入靶組織與受體結(jié)合，產(chǎn)生藥理作用后從體內(nèi)消除。竹紅菌素在臨床研究中顯示出廣泛的生物活性，但竹紅菌素較差的水溶性導(dǎo)致其生物利用度難以預(yù)料，這成為限制它在臨床上應(yīng)用的主要因素之一。目前，竹紅菌素臨床應(yīng)用僅限于外部皮膚用藥，如外陰白色病變、頭癬及牛皮癬等。關(guān)于竹紅菌素體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究較少，而這對于開發(fā)用于腫瘤治療的竹紅菌素口服和靜脈注射臨床制劑非常重要。

李廷慧［49］使用熒光檢測法對HB脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)進行了初步研究，使用最高有效劑量為2 mg/Kg，對正常小鼠一次性靜脈注射HB脂質(zhì)體后血清C-t曲線呈三室模型，HB脂質(zhì)體主要分布在血漿等細胞外液中，在體內(nèi)的半衰期短，多余的藥物排泄快，研究結(jié)果還為光動力治療微血管疾病時給藥——照光時間間隔的確定提供了參考。Guo等［50］用單乳劑揮發(fā)法制備了載有HA的PLGA納米粒（PLGA/HA NPs），其表征數(shù)據(jù)顯示HA被成功地包封于PLGA中，該納米粒的載藥量和包封率分別為7.0%和57.5%。體外釋放實驗表明，HA在pH 1.5和pH 6.8的溶液中比在pH 7.4的溶液中釋放緩慢；PLGA/HA NPs的水溶性是HA原藥（n-HA）的35.67倍；在生理環(huán)境下，PLGA/HA NPs也比n-HA更加穩(wěn)定。該研究首次建立了一種簡單、靈敏的LC-MS/MS方法，可有效地應(yīng)用于大鼠血漿中HA的定量檢測，對比大鼠口服給藥之后PLGA/HA NPs和n-HA藥代動力學(xué)參數(shù)及生物利用度，結(jié)果表明PLGA/HA NPs的生物利用度是n-HA的2.67倍，并且PLGA/HA NPs的半衰期更長。因此，PLGA包封的納米粒提高了HA水溶性、穩(wěn)定性，改善了HA生物利用度，可作為潛在的HA口服遞藥載體［50］。

3 竹紅菌素的生物合成代謝

竹紅菌素因其良好的抗腫瘤活性與潛力而備受關(guān)注，也引發(fā)了對其生物學(xué)特性、固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵、光動力療法等方面的研究，但是對于竹紅菌素的生物合成途徑以及參與生物合成的編碼基因，國內(nèi)外的研究則較少。

?？舻龋?1］在竹黃菌株Shiraiasp. SUPER-H-168中擴增出一條編碼聚酮合酶的基因g4PKS，該基因編碼了一條具有2 167個氨基酸的序列，而該氨基酸序列具有KS、ACP、TE和AT結(jié)構(gòu)域，研究還表明g4PKS是非還原型聚酮合酶。在此基礎(chǔ)上，他們擴增了KS片段，構(gòu)建了表達載體，使其在大腸桿菌中成功地表達。Deng等［52］以工作濃度為500 μg/mL的潮霉素B作為篩選標記，通過PEG轉(zhuǎn)化的方法成功將慢病毒PgfpHyg載體在Shiraiasp. SUPER-H168中進行表達，并過表達了多銅氧化酶（Multicopper oxidase，MCO）基因，過表達株的HA產(chǎn)量比對照提高了5倍，同時也提高了竹紅菌素代謝基因簇中一些其他基因的轉(zhuǎn)錄水平。Deng等在Shiraiasp. SUPER-H168中使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲 除 Major facilitator superfamily transporter（MFS），△MFS突變株失去產(chǎn)生竹紅菌素的能力且對竹紅菌素的耐受性下降，而△MFS回補菌株則恢復(fù)了竹紅菌素的生產(chǎn)能力和耐受性；致病性分析顯示△MFS突變株能夠降低對竹葉的侵害，而△MFS回補菌株在竹葉上產(chǎn)生的壞死斑與野生型菌株一致，結(jié)果表明竹紅菌素是竹黃導(dǎo)致竹葉壞死的毒性因子，MFS負責(zé)將竹紅菌素輸出細胞，從而降低竹紅菌素的毒性［53］。Lei等［54］對野生 型Shiraiasp. S8 和 Triton X-100（促進HA的合成和釋放）處理的菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序，從2 463個轉(zhuǎn)錄本中找到了在Triton X-100誘導(dǎo)下可能參與HA合成的23個基因，基因本體（Gene ontology，GO）分析表明，Triton X-100處理的菌株中參與跨膜轉(zhuǎn)運和氧化還原過程的基因表達不同，因此誘導(dǎo)菌絲中的生物合成及提高膜的滲透性以釋放HA是提高HA產(chǎn)量的原因。Deng等［55］在Shiraiasp. SUPER-H168中使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除聚酮合酶polyketide synthase基因（SbaPKS），在ΔSbaPKS突變株中檢測不到竹紅菌素。與野生型相比，ΔSbaPKS突變株的SbaPKS相對表達水平以及基因簇中其他基因的表達量顯著下調(diào)；致病性分析表明SbaPKS的缺失降低了竹紅菌素對竹葉的毒性作用，而SbaPKS過表達菌株則恢復(fù)了竹紅菌素的產(chǎn)量并導(dǎo)致竹葉產(chǎn)生壞死斑。結(jié)果證明SbaPKS基因參與竹紅菌素生物合成，并且竹紅菌素對竹葉的致病性起到了至關(guān)重要的作用［55］。Zhao等［56］對產(chǎn)竹紅菌甲素的野生型竹黃S. bambusicolaS4201-W進行紫外誘變，并篩選出一株不產(chǎn)竹紅菌甲素的突變株S4201-D1，連續(xù)傳代突變株S4201-D1后，以HPLC檢測該菌株均不產(chǎn)生竹紅菌甲素，表明遺傳穩(wěn)定性良好。為了研究參與竹紅菌甲素生物合成的基因以及合成通路，對野生型S4201-W和誘變型S4201-D1進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，與野生株S4201-W相比，S4201-D1中有716條unigenes上調(diào)，188條unigenes下調(diào)，其中7條unigenes參與竹紅菌甲素的生物合成，它們分別編碼多銅氧化酶（Multicopper oxidase）、成束蛋白（Fasciclin）、聚酮合酶（Polyketide synthase）、O-甲基轉(zhuǎn)移酶/FAD-依賴性單加氧酶（O-methyltransferase/FAD-dependent monooxygenase）、O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase）、羥化酶（Hydroxylase）和FAD/FMN-依賴性氧化還原酶（FAD/FMN-dependent oxidoreductase），從而推測出在一條在竹黃菌株S. bambusicolaS4201中存在的竹紅菌甲素（HA）的生物合成途徑。

4 展望

對竹黃和竹紅菌素的生物學(xué)與藥物活性、作用機制等研究正逐步深入，但還存在著許多亟待解決的問題。由于環(huán)境氣候、宿主條件等諸多因素，竹黃的地域分布具有一定的局限性；隨著原生地生境的變化，野生竹黃資源受到威脅，而竹黃的人工栽培尚未得到廣泛和有效的開展［4］。運用各種DNA分子標記技術(shù)對采集自不同地區(qū)的竹黃進行遺傳多樣性研究，了解竹黃群體遺傳結(jié)構(gòu)，掌握不同地區(qū)竹黃居群的起源與發(fā)育關(guān)系，可為竹黃種質(zhì)資源的保育奠定理論基礎(chǔ)。因此，需要在更廣的范圍對竹黃不同居群的生物學(xué)和遺傳多樣性進行深入研究。竹紅菌素作為一種安全、高效、低毒的抗腫瘤藥物，其價值和潛力正越來越受到關(guān)注，但是竹紅菌素的產(chǎn)量不穩(wěn)定、誘導(dǎo)細胞死亡的機制不明確、疏水性帶來的給藥困難、藥代動力學(xué)參數(shù)不完善等因素都限制其藥劑的開發(fā)和臨床使用。因此，在竹紅菌素的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)修飾或改性、抗癌機理、臨床應(yīng)用等方面仍需要系統(tǒng)性的深入研究。相信通過廣泛和深入的研究，依托現(xiàn)代生物技術(shù)，竹黃和竹紅菌素對于人類健康的巨大潛能一定會實現(xiàn)充分的發(fā)揮。

致謝：承南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生林羲和郭凌媛惠贈部分資料并給予有價值的建議，特此深致謝忱。

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