王佩 劉文 沈祥陵

（三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室（三峽大學(xué)） 湖北省三峽特色植物繁育工程技術(shù)研究中心 三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443002）

絲狀真菌通常分為3類，蕈菌、霉菌和酵母菌，它與人類生活息息相關(guān)，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療實踐、環(huán)境保護(hù)和生物學(xué)基本理論研究方面發(fā)揮著重要作用。但真菌易感染農(nóng)作物、動物，甚至包括人類在內(nèi)的生物體，常導(dǎo)致農(nóng)作物絕收、人類致命性疾病等問題。因此，國家每年投入數(shù)十億美元來控制農(nóng)產(chǎn)品中的霉菌毒素。目前，絕大多數(shù)真菌的次生代謝物正等待著被發(fā)現(xiàn)和鑒定，為此全基因組測序的真菌物種數(shù)量正在迅速增加。然而，使用傳統(tǒng)的方法研究真菌耗時費力，這是長期以來阻礙真菌實現(xiàn)基因編輯的主要原因。近年來，細(xì)菌和古細(xì)菌免疫CRISPR/Cas9機(jī)制被設(shè)計成強大的基因編輯系統(tǒng)，因其使用方便、構(gòu)建簡單、成本低、可以覆蓋大多數(shù)區(qū)域的基因編輯需求，而受到廣大研究人員的青睞。但由于某些真菌中極低的同源重組率、某些物種中缺乏質(zhì)粒體系，以及缺乏用于表達(dá)單鏈RNA（sgRNA）的RNA聚合酶III（RNA Pol III）啟動子等原因，使得CRISPR/Cas9體系在絲狀真菌中的發(fā)展非常緩慢。隨后，科研人員將該系統(tǒng)進(jìn)行了改良并應(yīng)用于真菌，使得基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)在真菌中的應(yīng)用也越來越多。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述

1.1 基本結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是古細(xì)菌在長期進(jìn)化過程中與病毒進(jìn)行斗爭形成的免疫工具，而CRISPR/Cas9是其中的一種，一般細(xì)菌中都含有1-2 個CRISPR/Cas基因座。典型的CRISPR/Cas系統(tǒng)是由CRISPR簇、Cas蛋白基因以及前導(dǎo)序列（Leader sequence）組成的。其中CRISPR簇由不連續(xù)的重復(fù)序列（Repeat）、長度相似的間隔序列（Spacers）按一定順序排列而成，重復(fù)序列是指一系列短的高度保守的正向序列，長度約21-47 bp，一般為32 bp［1-2］，且具有回文結(jié)構(gòu)或發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)［3］，重復(fù)次數(shù)可高達(dá)250次；間隔序列是指來源于病毒或者其他外源基因的片段，長度約為26-72 bp；Cas基因是一類保守的基因家族，主要編碼核酸酶、DNA 解旋酶、聚合酶等與切割、修飾相關(guān)的蛋白，一個CRISPR/Cas基因座通常包含4-20個不同的Cas基因，這些基因可以位于CRISPR重復(fù)間隔序列的上游或者下游；而Cas蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶，具有HNH 和RuvC兩個活性位點［4］，可以分別切割與crRNA 互補的DNA 鏈和非互補鏈，從而形成DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs），它與folk酶功能相似，但它并不需要形成二聚體來發(fā)揮作用；前導(dǎo)序列是指一段富含 A/T 堿基、包含啟動子、長度約20-534 bp的序列，通常位于重復(fù)間隔序列的5' 端。

1.2 最新分類

大多數(shù)古細(xì)菌和近一半細(xì)菌基因組中都有大量不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)。最新 CRISPR/Cas分類方案劃定兩大類，分別分為3種類型［5］。兩大類的CRISPR/Cas系統(tǒng)在效應(yīng)器模塊組成方面有很大不同。第1類系統(tǒng)包括I、III和IV型，存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，包含4-7個Cas蛋白質(zhì)亞基組成的效應(yīng)物復(fù)合物，如用于抗病毒防御的CRISPR相關(guān)復(fù)合物及III型系統(tǒng)的Csm/Cmr復(fù)合物。1類效應(yīng)復(fù)合物的大部分亞基，特別是Cas5、Cas6和Cas7都含有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域即RNA識別基序（RRM）。雖然I型和III型效應(yīng)復(fù)合物的單個亞基之間的序列相似性較低，但兩者具有顯著相似的總體結(jié)構(gòu)，可能起源于共同的祖先，同屬于1類系統(tǒng)。第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)包括統(tǒng)II型、V型和VI型，幾乎只存在于細(xì)菌中，效應(yīng)復(fù)合物由單個多結(jié)構(gòu)域蛋白組成。其中Cas9（II型）是2類系統(tǒng)中的典型代表，RNA依賴性內(nèi)切核酸酶包含兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC。

1.3 作用機(jī)制

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫可以分為3個步驟：適應(yīng)、表達(dá)和干擾［6］。在第一步適應(yīng)期間，來自入侵元件的外源DNA片段被處理并作為新的間隔片段并入CRISPR陣列；第二步表達(dá)涉及CRISPR陣列的轉(zhuǎn)錄，其后將前體轉(zhuǎn)錄物加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）。將crRNA與一種或多種Cas9蛋白組裝成CRISPR核糖核蛋白（crRNP）復(fù)合物；第三步干擾涉及由crRNP復(fù)合體內(nèi)的Cas9核酸酶定向切割同源病毒或質(zhì)粒。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的多面體和模塊化結(jié)構(gòu)使其能夠在基因編輯中發(fā)揮不可替代的作用。

1.4 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的因素

CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)在全球范圍內(nèi)掀起了一場基因編輯技術(shù)革命熱潮，該技術(shù)可以對基因組特定位點進(jìn)行靶向編輯，包括敲除、插入和修復(fù)等。它具有鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）不可比擬的優(yōu)勢。然而研究發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)雖然可以高效快速地進(jìn)行基因編輯，但脫靶效應(yīng)和PAM依賴性等嚴(yán)重制約了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

1.4.1 脫靶效應(yīng) 脫靶效應(yīng)（Off-target effects）是指種子序列（gRNA）沒有與靶點DNA序列相匹配，從而引入非預(yù)期基因突變的現(xiàn)象。編輯過程中g(shù)RNA與靶點DNA序列堿基錯配的出現(xiàn)［7］或gRNA序列中DNA凸起的形成［2］都可以形成gRNA與其他堿基的配對而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。此外，由于gRNA與目標(biāo)基因組結(jié)合的20 nt序列決定系統(tǒng)的靶向特異性，因此gRNA的長度對脫靶效應(yīng)也有很大的影響［8］，另有研究顯示，脫靶效應(yīng)還具有細(xì)胞特異性［9］。

針對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，已經(jīng)有多個實驗室進(jìn)行了研究，研究表明可以從3個方面來降低該技術(shù)的脫靶效應(yīng)。首先就是選擇合適的gRNA，gRNA分為種子區(qū)和非種子區(qū)，真正影響gRNA結(jié)合效率的是最接近PAM序列的1-5個堿基，因此在設(shè)計gRNA時要選擇特異性高的序列，尤其注意靠近PAM序列的5個堿基，與此同時，可以借助一些網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化工具［10］；第二，可以通過優(yōu)化含有g(shù)RNA的質(zhì)粒的濃度來降低脫靶效應(yīng)，因為過高的濃度會增加脫靶的概率，而過低的濃度則會降低正確的敲除效率［11］；第三，可以用失活的Cas9（d Cas9）與 Fok I 核酸內(nèi)切酶區(qū)域結(jié)合形成融合蛋白，僅僅兩個單體蛋白單體結(jié)合時才能發(fā)揮切割作用，此方法運用了d Cas9的識別作用和Fok I 核酸內(nèi)切酶的精準(zhǔn)切割作用，可大大降低脫靶效應(yīng)［12-13］。

1.4.2 PAM依賴性 PAM序列是CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)可以正確切割靶基因的基本條件，直接決定CRISPR的靶向特異性。該序列約為2-9 bp，位于靶DNA的3'末端。在常用的來自于釀膿鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)中PAM序列為NGG，來自于嗜熱鏈球菌的PAM序列為NGGNG和NNAGAAW；來自腦膜炎雙球菌的PAM序列為NNNNGATT［11，14］，它們都具有高度的保守性。如果不存在PAM序列，即使靶序列與gRNA 序列完全匹配，Cas9蛋白也不會對目標(biāo)序列位點進(jìn)行切割［15］。PAM序列的依賴性對切割的目標(biāo)序列造成了一定的限制，且PAM序列的堿基數(shù)的多少同樣對系統(tǒng)識別的特異性造成影響，越長的PAM序列具有越高的特異性。

2 CRISPR/Cas9在絲狀真菌中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9在酵母中的應(yīng)用

酵母，一類單細(xì)胞真菌，可用于釀造生產(chǎn)，也可為致病菌。目前已知的有1 000多種酵母。根據(jù)產(chǎn)生孢子的能力分為3種：子囊菌、擔(dān)子菌和假酵母。2013年，DiCarlo等［16］使用組成型Cas9瞬時表達(dá)gRNA，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建立CRISPR/Cas9表達(dá)體系，表明目標(biāo)雙鏈斷裂可以將單鏈寡核苷酸的同源重組率提高5倍，雙鏈寡核苷酸供體的同源重組率提高130倍。此外，在穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞中包含gRNA的質(zhì)粒和外源DNA的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致近100%的重組頻率。此方法為在酵母中進(jìn)行單位點特異性誘變和等位基因置換提供了一個簡單而強大的基因工程工具。

2014年，Bao等［17］報道了基于CRISPR/Cas的多基因編輯體系，可以在釀酒酵母中同時使多個基因產(chǎn)生雙鏈斷裂。通過設(shè)計攜帶iCas9（野生型Cas9變體）、反式編碼RNA（tracrRNA）和crRNA的超高拷貝數(shù)質(zhì)粒，以大大提高基因破壞效率。結(jié)果證明，在4 d內(nèi)實現(xiàn)了3個內(nèi)源基因CAN1，ADE2和LYP1的同時中斷，當(dāng)使用不同的靶位點時，整體效率從27%-87%不等。此外，3個參與控制皮質(zhì)醇生物合成途徑的基因ATF2，GCY1和YPR1在6 d內(nèi)以100%的效率同時被破壞。這種同源結(jié)合的CRISPR（HICRISPR）策略將是創(chuàng)建具有多個基因敲除的酵母菌株的有力工具。2015年，Jako?iūnas等［18］也報告了多重CRISPR/Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母中的發(fā)展和成功運用，對多達(dá)5個不同位點進(jìn)行了基因編輯。他們應(yīng)用基因工程工具，對所有可能的單、雙、三重、四重和五重基因破壞組合進(jìn)行分析，找到能大量生產(chǎn)甲羥戊酸的菌株，與野生型菌株相比，該菌株中甲羥戊酸的濃度提高了41倍。該研究結(jié)果表明這種多重基因編輯方法加速了功能基因組學(xué)和代謝工程的發(fā)展。2014年，Jacobs等［19］使用RNA（rrk1）的啟動子前導(dǎo)RNA和核酶構(gòu)建靶向指導(dǎo)RNA的表達(dá)載體，與組成型Cas9相結(jié)合，在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中實現(xiàn)無篩選標(biāo)記的特異性誘變，誘變效率接近100%。該體系可以快速有效地在裂殖酵母中進(jìn)行基因編輯，開啟了CRISPR/Cas9技術(shù)在裂殖酵母中運用的先河，使得因缺乏用于表達(dá)gRNA的RNA Pol III啟動子而導(dǎo)致CRISPR/Cas9基因組編輯體系在模式生物裂殖酵母中無法實施的說法不攻自破。2015年，Stovicek等［20］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在多種不相關(guān)的工業(yè)釀酒酵母菌株中實現(xiàn)了對一個基因的兩個等位基因的同時敲除，效率高達(dá)78%。由于釀酒酵母一般是二倍體或者多倍體，因此其基因編輯極具挑戰(zhàn)性，該實驗也為工業(yè)酵母的有效編輯提供了一個良好的平臺。同年，Horwitz等［21］在DiCarlo和Bao的基礎(chǔ)上利用酵母有利于同源重組的特性，描述了在釀酒酵母中使用CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡化方法，將多個DNA構(gòu)建體同時整合到基因組中的目標(biāo)位置，實現(xiàn)點突變的多重整合，并進(jìn)行單次轉(zhuǎn)化。該方法將可以對一組基因的功能進(jìn)行快速檢測，并確認(rèn)完整代謝途徑。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種非常規(guī)酵母，在污染物、污水處理、工業(yè)脂質(zhì)和檸檬酸生產(chǎn)中有重大意義。2016年，Schwartz等［22］在解脂耶氏酵母中建立了CRISPR/Cas9體系，其中單基因打靶效率高達(dá)92%。當(dāng)使用一種由RNA聚合酶III和tRNA合成的雜合啟動子表達(dá)gRNA時，效率會有所提高。為了進(jìn)一步提高效率，使用SCR1’-tRNAGly啟動子表達(dá)gRNA、UAS1B8-TEF表達(dá)密碼子優(yōu)化的cas9，使得編輯效率達(dá)到了100%。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在大型真菌中的應(yīng)用

2.2.1 靈芝 靈芝（Ganoderma）可以合成多種包括類固醇、生物堿等具有抗腫瘤、抗菌作用的生物活性物質(zhì)，然而靈芝中URA3基因卻阻礙了其中一種重要生物活性物質(zhì)——靈芝酸的合成。2017年，Qin［23］首次在靈芝中成功建立一個CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，經(jīng)過使用密碼子優(yōu)化的Cas9和體外轉(zhuǎn)錄的gRNA，在靈芝的基因組中形成雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ），促進(jìn)靈芝中URA3基因的破壞。在此過程中作者首先構(gòu)建一個CRISPR/Cas9表達(dá)載體，其中分別使用來自靈芝基因組的Pgpd啟動子和來自里氏木霉的Tpdc終止子來控制Cas9的轉(zhuǎn)錄，將Pgpd，glcas9，Tpdc和sdhb 表達(dá)盒連接到pMD18-T得到CRISPR/Cas9的表達(dá)載體pMD18-Glcas9，運用T7啟動子表達(dá)gRNAs，并將gRNAs與pMD18-T連接，得到pgRNA-1和pgRNA-2以便體外轉(zhuǎn)錄gRNA。然后通過改良的PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將CRISPR/Cas9表達(dá)載體轉(zhuǎn)入靈芝的原生質(zhì)體中，成功獲得能夠表達(dá)Cas9蛋白的靈芝菌株Gl-Cas9，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)66.6%。最后將100 μg gRNA轉(zhuǎn)入能夠成功表達(dá)Cas9蛋白的靈芝菌株Gl-Cas9，在兩個位點分別得到3個和5個突變體。從而使靈芝能夠產(chǎn)生更多具有抗腫瘤活性和抗轉(zhuǎn)移活性的靈芝酸，成為真正意義上的次級代謝物生產(chǎn)工廠。Qin等的研究不僅促進(jìn)了對高等真菌的代謝調(diào)控的理解，而且通過合理的遺傳方法加速了菌株的改良，有望為未來更高級真菌的深入研究和應(yīng)用提供有用的平臺。

2.2.2 灰蓋鬼傘 灰蓋鬼傘（Coprinopsis cinerea）是用于研究子實體發(fā)育的典型模式真菌，不僅可以作為食品而且是一種重要的資源，其全基因組的測序完成后，進(jìn)一步表明它擁有合成萜類化合物、酶的大量關(guān)鍵基因。因此，開發(fā)一種適用于灰蓋鬼傘的基因編輯技術(shù)非常重要。2017年，Sugano等［24］的研究闡明了一種基于CRISPR/Cas9的基因組編輯方法和一種高通量轉(zhuǎn)化方法。實驗中首先使用高通量檢測分析方法與冷凍保存的原生質(zhì)體，確定了一個新的啟動子——CcDED1pro，該啟動子活性高出常規(guī)啟動子GPD七倍。然后利用CcDED1pro啟動子作用于Cas9，來自灰蓋鬼傘U6-snRNA啟動子作用于gRNA，構(gòu)建載體。在灰蓋鬼傘中開發(fā)了高效的基因組編輯體系。最后，利用上述體系在穩(wěn)定的GFP表達(dá)體系中進(jìn)行CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的GFP誘變，并成功檢測到了GFP功能的喪失。該方法將為今后在食用菌中進(jìn)行基因編輯提供更好地參考。

2.3 CRISPR/Cas9在工業(yè)菌株中的應(yīng)用

2.3.1 里氏木霉 里氏木霉（Trichoderma reesei）是最廣泛使用的商業(yè)木質(zhì)纖維素分解酶制劑的主要來源，是不同異源蛋白和分泌蛋白質(zhì)的潛在細(xì)胞工廠，常被用來生產(chǎn)多種酶或代謝物。2015年，Liu等［25］在絲狀真菌里氏木霉中使用第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9實現(xiàn)了基因敲除，使里氏木霉成為繼酵母之后第二個利用CRISPR技術(shù)實現(xiàn)基因編輯的絲狀真菌。在這項研究中，Liu根據(jù)里氏木霉的密碼子頻率，優(yōu)化了化膿性鏈球菌的Cas9基因和核定位信號SV40，并通過融合增強的綠色熒光蛋白（eGFP）對其進(jìn)行檢測，獲得能夠永久表達(dá)cas9蛋白的菌株。由于在里氏木霉中缺乏RNA聚合酶III的啟動子，如擬南芥中的U6啟動子和釀酒酵母中的SNR52啟動子，使用試劑盒在體外轉(zhuǎn)錄后將gRNA引入細(xì)胞，隨后通過同源重組的方式將新序列引入到里氏木霉基因組的靶位點，實現(xiàn)了對其基因組的編輯。最后通過共轉(zhuǎn)化不同靶標(biāo)的gRNA和外源DNA（dDNA）來同時對多個基因進(jìn)行修飾，成功構(gòu)建了適用于里氏木霉中的CRISPR /Cas9多基因編輯系統(tǒng)。實驗結(jié)果表明，在對單一基因lae1進(jìn)行編輯時，重組頻率根據(jù)同源臂長度不同而有所差異，同源臂為0.2 kb-1.0 kb時，重組頻率分別為93%和100%。在對lae1和vib1兩個基因進(jìn)行編輯時，效率根據(jù)分子濃度比的不同而有所差異，當(dāng)分子濃度比gRNA-vib1∶dDNA-vib1∶gRNA-lae1∶dDNA-lae1 等于1∶1∶1∶1時，雙突變率僅為16%，當(dāng)比值改為1.5∶1∶1∶1時雙突變率增加到45%，表明多個基因的gRNA和dDNA的比例需要優(yōu)化才能達(dá)到高頻率的重組。當(dāng)基因數(shù)量增加到3個時，基因編輯效率為4.2%。雖然在多基因編輯時，重組頻率較低，卻也證明里氏木霉中可以利用CRISPR/Cas9實現(xiàn)3個以上基因的編輯。

2.3.2 產(chǎn)黃青霉 產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）是青霉屬無性絲狀真菌，一般分布于土壤、空氣及腐敗的有機(jī)材料等基質(zhì)中，素以其高效產(chǎn)生青霉素的能力而聞名，此外還能產(chǎn)生多種酶類及有機(jī)酸，是重要的工業(yè)真菌，在重金屬廢水處理過程中常被用作吸附劑。2016年，Pohl等［26］開發(fā)了強大的無篩選標(biāo)記的CRISPR/Cas9基因編輯工具用于產(chǎn)黃青霉DS68530（Δhdf A，ΔPen-cluster）和DS54468（Δhdf A）。一方面將體外合成gRNA和Cas9蛋白與外源DNA共同轉(zhuǎn)入DS68530菌株的原生質(zhì)體中；另一方面，使菌株表達(dá)Cas9蛋白，并在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄或?qū)塍w外合成的gRNA。從而獲得了amds和pks17突變菌株。由于基于AMA1的表達(dá)Cas9的質(zhì)粒會在無抗性壓力時將其丟掉，因此該方法避免了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對菌株的影響。

2.3.3 米曲霉菌 米曲霉（Aspergillus oryzae）是一類生產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除了可以產(chǎn)生蛋白酶外，還可產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和植酸酶等。在日本，米曲霉是用于傳統(tǒng)發(fā)酵、生產(chǎn)酶和異源蛋白質(zhì)的重要工業(yè)絲狀真菌。2013年，Jiang等［27］在米曲霉中建立了基于同源重組的編輯方法，然而這種技術(shù)在衍生自野生株RIB40的實驗室菌株運用效果較好。由于同源轉(zhuǎn)化體的分離挑戰(zhàn)，在工業(yè)型菌株中產(chǎn)生ku70和ligD缺失非常困難，因此，發(fā)展一種基于CRISPR/Cas9的基因編輯方法有重大的意義。這種技術(shù)將有助于在許多米曲霉工業(yè)菌株中產(chǎn)生有效的靶向誘變。2016年，Katayama等［28］構(gòu) 建 載 體pUNAFNC9gwA1-4，pUNAFNC9gyA和pUNAFNC9gpG分別用于基因wA、yA、pyrG的突變，其中使用amyB作為cas9的啟動子、來自米曲霉RNA聚合酶III識別的U6啟動子作為gRNA啟動子、SV40作為核定為信號、FLAG-tag作為蛋白表達(dá)與否的檢驗標(biāo)記。結(jié)果顯示會在突變體的靶基因位點實現(xiàn)1bp的敲除或插入，基因wA、yA和pyrG的突變率分別為20%、100%和10%，且Cas9的表達(dá)不會對米曲霉的生長造成影響。還表明突變率根據(jù)基因或PAM序列的不同而有所差別。該技術(shù)增加了米曲霉工業(yè)菌株中基因工程的廣泛運用，有助于其有效的分子育種。

2.3.4 粗糙脈孢菌 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa），作為生物遺傳學(xué)研究的模式生物數(shù)百年前已被研究，其中“一種基因一種酶”假說還獲得了1958年的諾貝爾獎［29］。但因該菌種缺乏非同源末端連接，因此對于此菌種來說基因編輯始終是一項艱巨的任務(wù)。伴隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，各大實驗室開始嘗試推廣使用此技術(shù)。2015年，Matsuura等［30］將該技術(shù)應(yīng)用于粗糙脈孢菌，將Cas9基因與trpC啟動子、SV40和定位信號、trpC終止子融合，gRNA與SNR52啟動子和SUP4側(cè)翼區(qū)融合，用β-微管蛋白的啟動子替換了粗糙脈孢菌中的clr-2（調(diào)節(jié)纖維素酶表達(dá)的核心轉(zhuǎn)錄因子之一）的啟動子，并在csr-1基因座處引入gsy-1（調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原）啟動子控制下的密碼子優(yōu)化的熒光素酶基因。在一定的范圍內(nèi)，cas9和gRNA載體的濃度越高，轉(zhuǎn)化效率越高，且β-微管蛋白啟動子驅(qū)動的clr-2菌株纖維素酶表達(dá)量顯著增加，還能用生物發(fā)光測定法篩選出表達(dá)的熒光素酶的菌株。

2.4 CRISPR/Cas9在致病菌株中的應(yīng)用

2.4.1 煙曲霉 煙曲霉（Aspergillus fumigatus）存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，是一種無處不在的腐生真菌，在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的碳和氮循環(huán)中起重要作用，但也是使個體免疫受損發(fā)、引起人和動物發(fā)病的重要病原菌，因此急需更好地了解真菌中的毒性決定因素。然而在真菌病原體煙曲霉中發(fā)生同源重組的效率非常低（5%），嚴(yán)重阻礙了其遺傳學(xué)研究。2015年，F(xiàn)uller等［31］檢測了CRISPR/Cas9在煙曲霉體中進(jìn)行基因突變的可行性，表明CRISPR/Cas9可以對煙曲霉聚酮合成酶基因（pksP）進(jìn)行高效率（25%-53%）突變，并成功獲得了具有預(yù)期基因組改變的突變體。同時設(shè)計實驗證明，Cas9核酸酶本身的組成型表達(dá)對煙曲霉生長無毒害作用。CRISPR/Cas9在煙曲霉基因功能研究中的應(yīng)用，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)與涉及發(fā)病機(jī)制的研究相結(jié)合，更有可能成為這一重要病原體的遺傳工具。2016年，Zhang等［32］也在煙曲霉中建立了一個高效的CRISPR/Cas9誘變系統(tǒng)，通過非常短（約35 bp）的同源臂在編輯過程中進(jìn)行精確高效的整合，準(zhǔn)確度約95%-100%，稱為微生物學(xué)介導(dǎo)的末端連接（Microhomology-mediated end joining，MMEJ）?；谠撓到y(tǒng)，作者已成功地實現(xiàn)了在預(yù)測位點高效和精確的整合外源GFP。此外，Zhang等還發(fā)現(xiàn)MMEJ介導(dǎo)的CRISPR/Cas9誘變獨立于ku80途徑，表明該系統(tǒng)可以作為臨床曲霉菌分離株中強大且通用的基因組編輯工具起作用。

2.4.2 玉米黑粉菌 玉米黑粉菌（Ustilago maydis）是一種活體營養(yǎng)型真菌，多年來已經(jīng)成為研究生物營養(yǎng)型植物病原體相互作用的真菌模型生物之一。它具有最小的真核病原體基因組，可以產(chǎn)生擔(dān)孢子，但單倍體的玉米黑粉菌并不具有感染力，只有在不同擔(dān)孢子相互交配后，才能形成具有感染性的二倍體，而b基因是控制其感染性的關(guān)鍵基因。因此，2016年，Schuster 等［33］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在玉米黑粉菌中建立了高效產(chǎn)生突變體的基因編輯體系。作者使用密碼子優(yōu)化的含有核定位信號和HA標(biāo)簽的Cas9、Potef啟動子、gRNA、來源于自身的U6啟動子以及酶切后的pMS7構(gòu)建載體，通過單步轉(zhuǎn)化法將這個可以自我復(fù)制的質(zhì)粒導(dǎo)入玉米黑粉菌SG200，實現(xiàn)了對基因bE2和bW1的編輯，突變效率高達(dá)70%。為了消除Cas9基因長期存在對菌株造成的負(fù)面影響，編輯成功后使用無抗性壓力的培養(yǎng)基，使菌株自然丟棄質(zhì)粒pMS7。相比第一個在釀酒酵母中建立的無外源DNA插入的CRISPR/Cas9體系，Schuster等的實驗說明在玉米黑粉菌中可以更加快速的進(jìn)行非同源末端重組修復(fù)。這項技術(shù)將有效破壞功能冗余基因或基因家族，對研究基因在玉米黑粉菌中的作用有很大幫助。

2.4.3 白色念珠菌 白色念珠菌（Candida albicans）是致病性酵母，又稱白假絲酵母菌，常導(dǎo)致免疫受損、個體致死性感染，死亡率極高。分子遺傳學(xué)工具的缺乏是目前對其發(fā)病機(jī)理分析研究的主要障礙。對于基因或基因家族的功能研究而言，缺乏減數(shù)分裂、質(zhì)粒系統(tǒng)以及白色念珠菌自身染色體數(shù)目不受嚴(yán)格控制等使得遺傳工程變得更加繁瑣［34-37］。2015年，Vyas 等［38］描述了一種運用于白色念珠菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，克服了該生物體內(nèi)基因工程的障礙。為了表達(dá)一種與念珠菌相容的Cas9，Vyas 等優(yōu)化了酵母菌的Cas9密碼子稱為CaCas9，避免使用CUG密碼子，確保與所有CTG進(jìn)化枝物種的相容性。CaCas9由組成型質(zhì)粒整合位點的ENO1啟動子表達(dá)，sgRNA由RNA聚合酶III啟動子SNR52表達(dá)，由于白色念珠菌中不存在可以自主復(fù)制的質(zhì)粒系統(tǒng)，因此通過轉(zhuǎn)化使構(gòu)建體進(jìn)入白色念珠菌SC5314的ENO1基因座。為了驗證該體系的效果，作者首先對基因ADE2（ade2突變賦予了易于觀察的紅色表型）進(jìn)行突變，隨后相繼獲得了基因URA3、RAS1、MtlA1、Mtlα2和TPK2的單突變體菌株，基因CDR1和CDR2的純合雙重突變體菌株；最后分離出許多種功能基因突變體，如dcr1/dcr1突變體、snf1-K81R/snf1-K81R突變體。CRISPR/Cas9針對靶基因的高頻率誘導(dǎo)突變使得能夠很容易地分離隱性純合突變體菌株。此外，該系統(tǒng)允許對多個基因進(jìn)行突變，從而為白色念珠菌的研究奠定了分子基礎(chǔ)。

2.4.4 水稻稻瘟病菌 2015年，Arazoe等［39］分別使用內(nèi)源性RNA聚合酶III識別的U6啟動子和RNA聚合酶II識別的TrpC啟動子表達(dá)的sgRNA，然后與對密碼子優(yōu)化的Cas9基因構(gòu)建的載體一起通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）的原生質(zhì)體中，在模式絲狀真菌稻瘟病中建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實現(xiàn)了對小柱孢酮脫水酶基因SDH的阻斷。結(jié)果表明，RNA引導(dǎo)的核酸酶的活性取決于靶基因位置，且RNA聚合酶II識別的TrpC啟動子表達(dá)核酸酶的活性低于RNAP III識別的U6啟動子，但兩者都能在SDH位點產(chǎn)生雙鏈斷裂。然而對基因SRS2而言，基于TrpC啟動子的載體轉(zhuǎn)染所獲得的轉(zhuǎn)化體中卻未檢測到SRS2基因替換?？傊搶嶒炞C明RNA介導(dǎo)的核酸酶可以通過同源重組介導(dǎo)的目標(biāo)基因置換高效率識別所需的序列并編輯內(nèi)源基因，且U6啟動子成為今后在稻瘟病中實現(xiàn)基因編輯的首選啟動子。這個系統(tǒng)將為絲狀真菌開發(fā)各種基于CRISPR/Cas9的應(yīng)用開辟新的道路。

2.4.5 構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉 2015年，N?dvig等［40］通過構(gòu)建一種特殊的CRISPR/Cas9表達(dá)載體嘗試在所有真菌中建立通用的CRISPR/Cas9體系。此載體包含復(fù)制起點、密碼子優(yōu)化的Cas9、tef1啟動子、tef1終止子、SV40核定為信號、gpdA啟動子、TrpC終止子、篩選標(biāo)記（AFUM_pyr G、AN_arg B、bleR和 hygR）、鑲嵌在RNA聚合酶II合成的較大轉(zhuǎn)錄物中間的gRNA等，根據(jù)篩選標(biāo)記的不同構(gòu)建了四個不同的載體用于多種菌種。結(jié)果顯示該體系成功的對構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的yA基因、棘孢曲霉的albA和pyrG基因進(jìn)行了突變。此外，作者還發(fā)現(xiàn)可以運用同一載體在5種不同的曲霉屬菌種中引入albA同源物的特異性突變，以促進(jìn)在不同絲狀真菌中引入常見突變。

3 展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)經(jīng)過4年的發(fā)展已經(jīng)達(dá)到了一定的高度。目前，大多數(shù)模式生物中都已經(jīng)實現(xiàn)了基因編輯，相比之前的ZFNs和TALENs系統(tǒng)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)表現(xiàn)出了極大的優(yōu)越性，同時也在真菌菌種改良、分子育種等方面表現(xiàn)出巨大的潛力，如已經(jīng)在缺乏非同源末端連接的粗糙脈孢菌、同源重組率極低的煙曲霉、缺乏減數(shù)分裂和質(zhì)粒系統(tǒng)的白色念珠菌等菌種中成功實現(xiàn)了基因編輯。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及人們對其認(rèn)識的逐漸深入，CRISPR/Cas9將會在大量的絲狀真菌中實現(xiàn)編輯，獲得更多的研究成果。但是，該技術(shù)在應(yīng)用中仍然存在許多亟待解決的問題，如脫靶、PAM依賴、細(xì)胞特異性等。所以，今后在運用該技術(shù)時，仍然要對同源臂的長短、質(zhì)粒的濃度、PAM的選擇等進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一個更加完善的CRISPR/Cas9基因編輯體系。

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