程楠 韓詠竹

肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD）又稱(chēng)Wilson?。╓ilson's disease，WD），是一種主要累及肝臟和大腦基底神經(jīng)節(jié)的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病，血清銅藍(lán)蛋白減低、24 h尿銅和肝銅含量增高是其主要生化改變［1］。包括筆者在內(nèi)的多項(xiàng)WD流行病學(xué)研究表明，中國(guó)人WD的患病率明顯高于歐美人群，尤應(yīng)受到臨床醫(yī)師的關(guān)注和重視［2?3］。

作為可治性神經(jīng)遺傳病，早期診斷和及時(shí)干預(yù)治療對(duì)WD的病情和預(yù)后至關(guān)重要。由于WD患者與雜合子之間的銅代謝檢查結(jié)果存在部分重疊，在判斷WD家系成員和臨床表現(xiàn)不典型的WD疑診患者是否患病抑或是雜合子時(shí)存在困難，而基因診斷有著不可比擬的價(jià)值，其重要性日益凸顯，與之相關(guān)的基因治療研究也方興未艾［4?6］。現(xiàn)根據(jù)文獻(xiàn)將應(yīng)用于WD分子診斷的各種基因診斷方法、適應(yīng)范圍及近年來(lái)基因治療的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要概括，以期對(duì)WD患者的臨床診療有所裨益。

1 WD基因及其發(fā)病機(jī)制

WD基因（ATP7B基因）位于13q14.3，全長(zhǎng)約80 kb，含有21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子，其cDNA編碼一種由1 465個(gè)氨基酸殘基組成的P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（ATP7B蛋白）。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)500種ATP7B基因的突變類(lèi)型，多為復(fù)合雜合突變，純合突變少見(jiàn)，不同種族和人群的突變特征存在明顯差異［5，7］。

研究表明，WD患者因ATP7B基因突變，位于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（trans Golgi network，TGN）的ATP7B蛋白功能缺陷，不能將肝細(xì)胞中的銅離子與銅藍(lán)蛋白前體結(jié)合而出現(xiàn)銅藍(lán)蛋白合成障礙，同時(shí)位于膽管膜側(cè)的ATP7B蛋白不能將細(xì)胞內(nèi)多余的銅離子隨膽汁排出，導(dǎo)致過(guò)量的銅在肝臟、大腦和角膜等部位沉積而發(fā)病，患者以急慢性肝炎、肝硬化、錐體外系癥狀及角膜K?F環(huán)等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可危及生命［8］。

2 WD的基因診斷

基因診斷可對(duì)無(wú)臨床表型的癥狀前期WD患者或雜合子作出準(zhǔn)確診斷，特別對(duì)有家族史的個(gè)體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶WD致病基因具有指導(dǎo)意義。現(xiàn)簡(jiǎn)要介紹各種先后應(yīng)用于WD基因診斷的技術(shù)方法。

2.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）?家系連鎖分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymor?phism，SSCP）、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real?time PCR，QPCR）分析

自上世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后探索采用RFLP?家系連鎖分析、SSCP、DHPLC和QPCR分析等各種用于遺傳病基因診斷的技術(shù)開(kāi)展了WD基因診斷的研究，并嘗試將其用于WD疑診患者、無(wú)臨床癥狀的WD家系成員及WD雜合子的診斷［9?12］。受當(dāng)時(shí)技術(shù)條件限制，這些方法均存在明顯的缺陷：RFLP?家系連鎖分析需與同一家系的先證者進(jìn)行比較，不能對(duì)無(wú)WD家族史或家系中先證者已死亡的可疑WD患者進(jìn)行診斷；SSCP、DHPLC和QPCR分析雖然操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高，但均不能明確ATP7B基因突變的部位和性質(zhì)。隨著DNA Sanger測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和普及，這些方法已較少用于WD的基因診斷。

2.2 DNA Sanger測(cè)序分析

由于能明確ATP7B基因突變的具體部位和性質(zhì)，采用DNA Sanger測(cè)序?qū)D基因各外顯子進(jìn)行序列分析是最為準(zhǔn)確可靠的方法，被公認(rèn)為WD基因診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。自Thomas等首先采用該技術(shù)檢測(cè)WD患者基因突變以來(lái)，針對(duì)不同種族和人群WD患者的研究積累了大量的研究資料并用于 WD 的臨床診斷［4?5，12］。

筆者等［13］采用Sanger測(cè)序?qū)?lái)自我國(guó)華中和華東地區(qū)的139例非同源家系的WD患者ATP7B基因第13號(hào)外顯子進(jìn)行DNA序列檢測(cè)，結(jié)果共檢出6種ATP7B基因的突變類(lèi)型和1種多態(tài)，其中p.Gly988Val雜合突變?yōu)槭状螆?bào)道，總的檢出率為29.49%（41/139），染色體突變頻率為16.19%（45/278），證實(shí)了第13號(hào)外顯子是中國(guó)人WD基因的突變熱區(qū)之一。Dong等［14］應(yīng)用DNA直接測(cè)序技術(shù)在632例無(wú)血緣關(guān)系的中國(guó)人WD患者中共檢出161種ATP7B基因的突變，其中58種為新的發(fā)現(xiàn)，總檢出率超過(guò)90%（569/632），其中有14種突變類(lèi)型占所有檢出突變患者的94%（537/569）。該研究不僅得到較為完整的中國(guó)人WD基因突變譜，且進(jìn)一步證實(shí)了WD基因呈少數(shù)高頻突變類(lèi)型較為集中而罕見(jiàn)突變類(lèi)型散在分布的特點(diǎn)。

DNA Sanger測(cè)序雖然準(zhǔn)確性和可靠性均較高，但對(duì)人員、設(shè)備要求高，難在一般醫(yī)院中推廣。由于WD基因全長(zhǎng)約80 kb，各外顯子突變形式多種多樣，對(duì)所有外顯子逐一測(cè)序分析花費(fèi)高、周期長(zhǎng)，且不能對(duì)其非編碼區(qū)進(jìn)行逐一檢測(cè)，因此，WD的基因診斷亟需各種高通量且費(fèi)用相對(duì)低廉的檢測(cè)方法。

2.3 DNA微陣列芯片突變分析

DNA微陣列芯片突變分析技術(shù)因其固相雜交而具有的并行性和高通量等特點(diǎn)，在生物分子信息獲取、基因多態(tài)性檢測(cè)和基因表達(dá)譜監(jiān)測(cè)等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)［15］，與WD基因高度遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)相契合，一度被認(rèn)為是極具潛力的WD基因檢測(cè)方法。如Gojová等［16］開(kāi)發(fā)了一種可檢測(cè)87種ATP7B基因突變的DNA微陣列芯片，在97例捷克和斯洛伐克的WD患者中檢出43種突變。Mathur等［17］則應(yīng)用一種可用于檢測(cè)ATP7B基因突變的低密度DNA微陣列芯片技術(shù)，在印度裔WD患者中檢出62種突變，其敏感性超過(guò)80%。但由于該技術(shù)固有的假陽(yáng)性或假陰性率高等缺陷，目前已被更高通量和準(zhǔn)確性且更具性?xún)r(jià)比的Mas?sARRAY和二代測(cè)序技術(shù)（next?generation sequenc?ing，NGS）替代。

2.4 MassARRAY突變分析

MassARRAY是將多重PCR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和芯片技術(shù)以及生物信息學(xué)方法結(jié)合于一體的新一代分子生物學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、高質(zhì)量、低成本、簡(jiǎn)單、靈活等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛用于基因分型、表觀遺傳學(xué)、拷貝數(shù)變異、病原體分型和產(chǎn)前診斷等研究［18］。由于WD的基因突變以點(diǎn)突變形式為主，MassARRAY是進(jìn)行大樣本、高通量WD基因突變檢測(cè)的有力工具。筆者等［19］基于該技術(shù)平臺(tái)篩查了來(lái)自800個(gè)不同家系的1 222例WD確診患者的ATP7B基因突變，結(jié)果在1 084例患者檢出63種已知的突變類(lèi)型，其中超過(guò)80%患者的突變位于第8、13、18、16和12外顯子?；蛐团c臨床表現(xiàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出p.Arg778Leu突變的患者發(fā)病年齡更低，且其銅代謝指標(biāo)（銅藍(lán)蛋白和血清銅）的水平也顯著低于未檢出該突變的患者；檢出p.Arg919Gly突變的多為腦型患者（以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀起?。鴻z出p.Thr935Met突變的患者則多為腦?內(nèi)臟型患者（神經(jīng)系統(tǒng)和肝、腎等臟器均明顯受損）。該研究證實(shí)了MassARRAY用于檢測(cè)WD患者基因突變的優(yōu)勢(shì)和價(jià)值。

2.5 NGS突變分析

NGS作為新興的高通量測(cè)序技術(shù)，一次可以對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得一次性對(duì)一種物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行細(xì)致全貌分析成為可能，是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一次革命，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)特別是基因組學(xué)研究的方方面面，例如基因組從頭測(cè)序（de novo）、重測(cè)序（re?sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究等［20?21］。

由于NGS的高通量檢測(cè)特性與WD基因的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和突變的高度異質(zhì)性相契合，近年來(lái)將其應(yīng)用于WD基因診斷的研究倍受關(guān)注，相關(guān)的報(bào)道呈增多趨勢(shì)。如Poon等［22］采用了MiSeq平臺(tái)的NGS靶向技術(shù)檢測(cè)了12例WD患者ATP7B基因的部分啟動(dòng)子區(qū)和全部編碼區(qū)序列，深度測(cè)序（＞100X）結(jié)果共檢出13種已知突變和一種未曾報(bào)道的c.1332delC缺失突變，其結(jié)果與Sanger測(cè)序的符合率為100%。筆者等［19］在前述研究中則應(yīng)用NGS檢測(cè)了在MassARRAY平臺(tái)未檢出ATP7B基因突變的138例WD患者，結(jié)果共檢出25種突變類(lèi)型，其中9種為未曾報(bào)道的突變類(lèi)型。在此基礎(chǔ)上，筆者等與相關(guān)單位合作，采用AmpliSeq方案設(shè)計(jì)了包含303個(gè)擴(kuò)增子的ATP7B基因全外顯子檢測(cè)Panel，在平均測(cè)序深度約1000X的情況下，其編碼區(qū)的覆蓋率約99.5%，利用Ion Torrent高通量NGS平臺(tái)完成了2 853例WD患者DNA樣本的檢測(cè)，已初步分析檢測(cè)到435種與WD相關(guān)的致病突變或疑似致病突變（未發(fā)表）。這些研究結(jié)果展示了NGS在WD基因診斷中所具有的廣闊應(yīng)用前景。

3 WD的產(chǎn)前診斷和植入前診斷

產(chǎn)前診斷可以在出生前即可診斷胎兒是否為WD患者，決定是否繼續(xù)妊娠，從而防止WD患兒的出生，對(duì)降低WD的發(fā)病率、提高出生人口的素質(zhì)有決定性意義。

早于WD基因克隆前，Cossu等［23］于1992年即報(bào)道采用RFLP?家系連鎖分析方法對(duì)WD家系成員進(jìn)行產(chǎn)前診斷的研究。在WD基因克隆后，有學(xué)者采用直接分析ATP7B基因突變的方法對(duì)WD家系成員實(shí)施產(chǎn)前診斷。如杜娟等［24］采用DHPLC技術(shù)對(duì)6個(gè)WD家系的父母親、先證者和胎兒行ATP7B基因突變的篩查，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證在2個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)存在ATP7B基因突變的異常胎兒，證實(shí)了DHPLC在WD突變檢測(cè)和產(chǎn)前診斷中應(yīng)用價(jià)值。

由于常規(guī)的產(chǎn)前診斷方法均需在妊娠過(guò)程中從孕婦羊膜腔抽取羊水提取胎兒的基因組DNA，系有創(chuàng)性的侵入性檢查，有可能影響孕婦和胎兒的安全，因此有學(xué)者探索采用各種無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展WD產(chǎn)前診斷的研究。如Lv等［25］采用外周血單分子擴(kuò)增和重測(cè)序技術(shù)（circulating single?molecule amplification and resequencing technology，cSMART）這一無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)對(duì)4個(gè)WD家系進(jìn)行了研究。該研究首先采用Sanger測(cè)序和全外顯子組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了WD家系父母親和先證者ATP7B基因的突變，然后采用cSMART從孕婦外周血分離胎兒基因組并檢測(cè)是否發(fā)生ATP7B基因的突變。經(jīng)羊膜腔抽取羊水后的產(chǎn)前診斷證實(shí)，有1個(gè)WD家系的胎兒與先證者基因型相同，為發(fā)生WD基因突變的患者，從而驗(yàn)證了無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷應(yīng)用于WD的可行性。

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplatation genet?ic diagnosis，PGD）可利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)選擇無(wú)遺傳性疾病的胚胎植入子宮，使有遺傳病史的夫婦獲得健康的嬰兒，避免生出有病的后代以及反復(fù)人工流產(chǎn)或者引產(chǎn)導(dǎo)致的身體、精神上的創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)上的損失［26］。雖然到目前為止尚未見(jiàn)WD家系行PGD的報(bào)道，但隨著單細(xì)胞基因組測(cè)序［27］以及基于NGS靶向測(cè)序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，WD家系行PGD已逐漸成為可能。

4 WD的基因治療

目前以青霉胺為代表的金屬絡(luò)合劑驅(qū)銅治療和硫酸鋅或葡萄糖酸鋅等鋅劑為主的競(jìng)爭(zhēng)抑制銅吸收等治療方法均可在不同程度上糾正WD患者體內(nèi)銅的“正平衡”而具有改善病情的作用，但這些方法均為對(duì)癥治療，且有相當(dāng)一部分患者不能耐受青霉胺等藥物的不良反應(yīng)，使其治療范圍和效果嚴(yán)重受限。原位肝移植治療雖能挽救一部分以暴發(fā)性肝功能衰竭起病的腹型WD患者的生命，但受器官移植后免疫排斥反應(yīng)、費(fèi)用昂貴及肝源獲取困難等限制，難以作為常規(guī)治療方法［4，6，28］。作為單基因遺傳病，且其致病基因的定位、結(jié)構(gòu)和功能均較為明確，WD最理想的治療方法當(dāng)屬基因治療。

基因治療是指以遺傳學(xué)原理及基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，在分子水平進(jìn)行修補(bǔ)、矯正、替代缺陷基因或調(diào)控其表達(dá)的治療方法。由于目前WD的基因治療均以動(dòng)物模型為研究對(duì)象，選擇符合WD遺傳背景的動(dòng)物模型是判定基因治療能否成功的重要環(huán)節(jié)。但目前應(yīng)用于WD基因治療的LEC大鼠、TX小鼠及atp7b（?/?）小鼠的表型雖然與WD類(lèi)似，但其遺傳背景、生化特征與WD患者存在較大差異［29］?；诖?，Jiang 等［30］應(yīng)用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得了p.Arg778Leu基因型（中國(guó)人WD患者的高頻突變位點(diǎn)）的ATP7B基因點(diǎn)突變兔子，發(fā)現(xiàn)其肝銅含量逐漸增高（最高超過(guò)對(duì)照組9倍），從而得到了最接近于中國(guó)人WD遺傳背景的動(dòng)物模型，為下一步WD基因治療的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

為了解決替代基因的靶向性和載體的安全性等問(wèn)題，Murillo等［31］以改造的腺相關(guān)病毒8（adeno?associated vector serotype 8，AAV8）為載體，將人全長(zhǎng)ATP7B基因通過(guò)靜脈注射的方法導(dǎo)入atp7b?/?小鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)其能在肝臟組織中長(zhǎng)期表達(dá)，并能部分糾正銅代謝的異常。Roybal等［32］則將含有人野生型ATP7BcDNA和肝臟特異性啟動(dòng)子的重組慢病毒（lentivirus）載體采用羊膜腔注射的方法進(jìn)行atp7b?/?小鼠基因治療的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出生后的模型小鼠肝組織出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的重組人ATP7B蛋白的表達(dá)，且銅代謝異常也有明顯改善。盡管這些研究尚處于實(shí)驗(yàn)室探索階段，走向臨床應(yīng)用尚有待時(shí)日，但這些研究結(jié)果顯現(xiàn)出基因治療應(yīng)用于WD的誘人前景。

5 小結(jié)

綜上所述，目前各種應(yīng)用于WD的基因診斷方法中，DNA Sanger測(cè)序的重要性不言而喻，NGS靶向測(cè)序等高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用被認(rèn)為是近年來(lái)WD分子診斷領(lǐng)域最重要的進(jìn)展。而基于WD基因診斷技術(shù)之上的產(chǎn)前診斷特別是非侵入性的PGD可使有家族史或存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)的WD家系成員避免生出有病患兒，在真正意義上阻斷WD的發(fā)生，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育和提高出生人口的素質(zhì)有重要意義。但由于產(chǎn)前診斷和PGD涉及生殖醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、組織胚胎學(xué)等領(lǐng)域，技術(shù)門(mén)檻高且涉及“胎兒設(shè)計(jì)”和非醫(yī)學(xué)的性別選擇等醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題，因此，除了在診斷技術(shù)上實(shí)現(xiàn)高靈敏度和準(zhǔn)確度外，嚴(yán)格的準(zhǔn)入制度、成熟的技術(shù)流程以及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的支持是其在臨床中規(guī)范化推廣應(yīng)用的前提保證。雖然基因治療作為WD的根治方法尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，但隨著CRISPR/Cas9等新一代基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和逐漸成熟，在分子水平精確修正WD的突變基因在不久的將來(lái)有可能成為現(xiàn)實(shí)。