闕春杏 ，虞逸靜 ，陳 晗 ，史 程 ，薛愛民 ，3

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局虹口分局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，上海200434；3.上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083）

冠狀動脈痙攣是指局部冠狀動脈對各類刺激的過收縮反應(yīng)，其直接結(jié)果是冠狀動脈部分或完全閉塞，在變異型心絞痛及其他類型的心絞痛甚至心肌梗死、猝死的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。1845年，Latham就提出了冠狀動脈痙攣可導(dǎo)致心絞痛，直到1959年，PRINZMETAL等[1]學(xué)者首次報道了變異型心絞痛，此類型心絞痛與勞力性心絞痛不同，常于靜息狀態(tài)下發(fā)作，伴有ST段抬高，同時提出冠狀動脈痙攣與其相關(guān)。直到1973年，OLIVA等[2]通過冠狀動脈造影最終證實此假說成立。此后，冠狀動脈痙攣在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病尤其是急性冠脈綜合征發(fā)病機制中的地位受到越來越廣泛的關(guān)注和認同。臨床上，冠狀動脈痙攣好發(fā)于青年女性，發(fā)作時間多為凌晨，ST段抬高、冠狀動脈無病變，但具有典型臨床特征的胸痛患者常常被認為受到冠狀動脈痙攣的影響[3]。發(fā)生痙攣的冠狀動脈造成所在供血區(qū)域突發(fā)缺血，極易造成心肌梗死發(fā)生，若梗死范圍較大或發(fā)生在其他重要部位，則有導(dǎo)致猝死的風(fēng)險。2000年，一項日本多中心研究[4]表明，日本人群存在冠狀動脈痙攣者高達40.9%。2008年，ONG等[5]也表明約50%的急性冠脈綜合征患者可被乙酰膽堿誘發(fā)冠狀動脈痙攣。冠狀動脈痙攣的發(fā)病率也存在種族差異。有學(xué)者[6]認為，西方人的發(fā)病率相對較低，而日本人及韓國人的發(fā)病率相對較高，并且日本人中彌漫性冠狀動脈痙攣（多支冠狀動脈發(fā)生冠狀動脈痙攣）更為常見。由于受各方面條件限制，我國在此方面的研究較少，本文綜合國內(nèi)外冠狀動脈痙攣的研究，就其發(fā)病機制和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進行綜述。

1 冠狀動脈痙攣的誘因

冠狀動脈痙攣的誘因主要分為生理因素與藥理因素兩大類[7]。生理因素包括勞累、精神應(yīng)激、寒冷刺激、瓦爾薩爾瓦動作、過度通氣、鎂缺乏等，另外冠狀動脈痙攣本身也可參與而構(gòu)成惡性循環(huán)。藥理因素包括煙、酒、兒茶酚胺、組胺、擬副交感神經(jīng)藥、抗膽堿酯酶藥、麥角新堿、β受體阻滯劑、可卡因、長期應(yīng)用硝酸甘油者突然撤藥等。此兩大類因素可分別單獨誘發(fā)冠狀動脈痙攣，若兩者并存時，則發(fā)病率更高。

2 冠狀動脈痙攣的分子機制

雖然氧化應(yīng)激引起的血管收縮、慢性炎癥造成的血漿C反應(yīng)蛋白升高、自主神經(jīng)興奮性增高及遺傳因素等是冠狀動脈痙攣的常見機制[8]，但這些因素主要造成血管內(nèi)皮功能障礙或血管平滑肌興奮性增高等[8]。因此，本文將重點討論血管內(nèi)皮功能障礙和平滑肌興奮性增高在冠狀動脈痙攣中的作用，并選取主要的分子標(biāo)志物，介紹其在介導(dǎo)冠狀動脈痙攣中的作用。

2.1 血管內(nèi)皮功能障礙

血管內(nèi)皮細胞作為全身血管內(nèi)和血管外成分的重要屏障之一，在血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維系方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[9]。同時，血管張力的維持和調(diào)節(jié)有賴于內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放的血管活性因子，其中主要的血管舒張因子有一氧化氮、前列環(huán)素，主要的血管收縮因子有內(nèi)皮素（endothelin，ET）-1。在生理情況下，血管舒張因子和血管收縮因子處于動態(tài)平衡之中。血管舒張劑如乙酰膽堿，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮而實現(xiàn)其擴血管作用[10]。然而，具有冠狀動脈痙攣病變的患者，可被醋甲膽堿或乙酰膽堿誘發(fā)冠狀動脈痙攣[11-12]。有研究[10，13-15]發(fā)現(xiàn)：乙酰膽堿、5-羥色胺和組胺等，在健康人身上通過促進內(nèi)皮源性一氧化氮的釋放，進而發(fā)揮擴張冠狀動脈的作用；而在存在動脈粥樣硬化病變的患者身上，則誘發(fā)冠狀動脈痙攣。由此可見，冠狀動脈痙攣的患者，存在冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙。

2.1.1 內(nèi)皮源性一氧化氮在冠狀動脈痙攣中的作用

1980年，F(xiàn)URCHGOTT等[16]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞能分泌一種內(nèi)皮源性舒張因子，并確認其為一氧化氮，自此之后，內(nèi)皮細胞在調(diào)節(jié)局部血管張力中的作用逐漸被揭示。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸的反應(yīng)中產(chǎn)生一氧化氮。硝酸甘油在人體內(nèi)被分解，釋放出一氧化氮，后者激活鄰近的平滑肌細胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，間接促進環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的大量產(chǎn)生[10]，從而導(dǎo)致平滑肌舒張，冠狀動脈痙攣緩解。當(dāng)內(nèi)皮細胞存在eNOS缺陷時，痙攣的冠狀動脈對硝酸甘油處于高反應(yīng)狀態(tài)[17]，硝酸甘油的生理效應(yīng)更為顯著。進一步研究揭示，eNOS抑制劑單甲基-L-精氨酸能導(dǎo)致健康人的冠狀動脈顯著收縮，卻對冠狀動脈痙攣患者的冠狀動脈無此效應(yīng)[18]。由此可知，一氧化氮的舒張血管作用極有可能僅用于維持血管的基礎(chǔ)張力水平，而在痙攣的冠狀動脈中無此作用。

現(xiàn)有研究[19]發(fā)現(xiàn)，eNOS的基因突變可能通過改變一氧化氮的釋放量從而參與調(diào)節(jié)冠狀動脈痙攣的發(fā)生，不排除其機制與內(nèi)皮細胞功能障礙相關(guān)的可能性。1997年，YOSHIMURA等[20]首先在日本人中發(fā)現(xiàn)Glu298Asp多態(tài)性和冠狀動脈痙攣的關(guān)系。CHANG等[21]在韓國選取102名變異型心絞痛患者進行研究，發(fā)現(xiàn)：其中21.5%的人存在eNOS基因的Glu298Asp突變；eNOS基因的Glu298Asp突變可較好地預(yù)測冠狀動脈痙攣風(fēng)險（OR=2.83）。盡管Glu298Asp突變與冠狀動脈痙攣密切相關(guān)，然而，該突變的效應(yīng)是否通過影響一氧化氮的釋放起作用存在爭議。SOFOWORA等[22]報道了健康人中Glu298Asp突變型較野生型釋放更少的一氧化氮。TESAURO等[23]和FAIRCHILD等[24]則認為Glu298Asp突變與否對一氧化氮的釋放無明顯影響。此外，在eNOS基因的5′側(cè)翼區(qū)的T-786C多態(tài)性也被證實與冠狀動脈痙攣存在密切關(guān)系。研究[7，25-29]發(fā)現(xiàn)，在日本人、巴西白人和非裔巴西人中，T-786C突變后可通過減少一氧化氮的產(chǎn)生而在一定程度上促進冠狀動脈痙攣的發(fā)生。GLUECK等[30]深入研究發(fā)現(xiàn)，美國白人中變異型心絞痛患者的T-786C位點的突變率遠高于健康人。

2.1.2 ET-1在冠狀動脈痙攣中的作用

ET-1主要由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌，是強烈的內(nèi)源性縮血管物質(zhì)。LEE等[31]曾報道韓國冠狀動脈痙攣人群中，血漿ET-1存在基因多態(tài)性，并提示血漿ET-1的變化可能由其基因多態(tài)性所致。張金霞等[32-34]在中國人群中發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈痙攣患者的血漿ET-1水平顯著高于健康人群和冠狀動脈狹窄的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者。LEE等[31]也發(fā)現(xiàn)韓國冠狀動脈痙攣人群的血漿ET-1基因的突變主要在外顯子-5第5665位點、外顯子-1+138位點和內(nèi)含子-4第8002三個位點這三個位點，并且ET-1的水平與此三個突變密切相關(guān)。曾菁等[35]在中國人群中展開研究：一方面發(fā)現(xiàn)在上述三個位點的突變與血漿ET-1水平關(guān)系密切；另一方面，通過對基因組的分析，發(fā)現(xiàn)等位基因4A（在第8002位點為A，在第5665位點為T的突變）與冠狀動脈痙攣的發(fā)生具有明顯的聯(lián)系，而等位基因3A（在第8002位點為G，在第5665位點為G的突變）則對冠狀動脈痙攣的發(fā)生起保護作用。目前研究[36]提示，血漿ET-1水平和冠狀動脈痙攣的發(fā)生關(guān)系密切，而前者與其基因多態(tài)性的相關(guān)性則有待深入探究。

此外，低密度脂蛋白[37]和吸煙[38]可以誘導(dǎo)動脈血管平滑肌細胞ET A型（ETA）受體或ET B2型（ETB2）受體的表達，使血管敏感性增加，表現(xiàn)為平滑肌高反應(yīng)性和ET-1收縮效應(yīng)的顯著增強，增加冠狀動脈痙攣的發(fā)生風(fēng)險。

2.2 血管平滑肌興奮性增高

血管收縮依賴于細胞內(nèi)Ca2+濃度和平滑肌對Ca2+的敏感程度兩個關(guān)鍵因素。當(dāng)平滑肌細胞受到刺激，細胞內(nèi)外鈣通道打開，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高至激活濃度時，Ca2+便與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，進而通過一系列反應(yīng)激活肌球蛋白，并激活其上的ATP酶使之分解ATP產(chǎn)生能量令橫橋扭動，平滑肌收縮。在激活肌球蛋白的過程中，肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化和Rho激酶共同參與平滑肌細胞對Ca2+增敏的調(diào)節(jié)。在缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等情況下，血管平滑肌細胞將啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），后者與 MLC的磷酸化相互影響，介導(dǎo)血管的過度收縮和痙攣，ERS或為冠狀動脈痙攣的重要始動因素。因此，血管平滑肌興奮性增高可能是冠狀動脈痙攣的重要病理生理機制之一。

2.2.1 MLC磷酸化在冠狀動脈痙攣中的作用

肌球蛋白為包括2個肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和 2 對輕鏈（MLC1 和 MLC2）的六聚體。其中以MLC2為功能代表的肌球蛋白在Ser19和Thr18位點可被磷酸化[39-40]。冠狀動脈痙攣與MLC磷酸化的增強密切相關(guān)[41]。Ca2+-鈣調(diào)蛋白活化的MLC激酶（myosin light chain kinase，MLCK）及隨后發(fā)生的MLC調(diào)節(jié)亞基的磷酸化共同啟動血管平滑肌的收縮[42]。磷酸化的MLC進而活化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶，從而允許橫橋循環(huán)的發(fā)生，最終導(dǎo)致平滑肌收縮力的產(chǎn)生以及血管收縮[42]。在白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）β誘導(dǎo)的豬冠狀動脈痙攣模型中，冠狀動脈痙攣段的MLC單磷酸化水平和雙磷酸化水平均升高，而正常冠狀動脈并未發(fā)現(xiàn)MLC雙磷酸化水平的升高[43]。在培養(yǎng)的平滑肌細胞中，MLC的雙磷酸化在活躍生長的平滑肌細胞中具更高水平[44]。這些結(jié)果提示了MLC雙磷酸化僅在冠狀動脈痙攣區(qū)的平滑肌細胞內(nèi)發(fā)生。

2.2.2 Rho激酶在冠狀動脈痙攣中的作用

體外實驗[45]表明，鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白可以調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的MLC磷酸酶的敏感性。Rho GTP酶參與調(diào)節(jié)平滑肌對Ca2+的敏感性[46-48]。Rho通過調(diào)節(jié)其靶酶Rho激酶以及肌球蛋白激酶的肌球蛋白結(jié)合亞基（myosin-binding subunit，MBS）來調(diào)節(jié)MLC的磷酸化[49-50]?；罨腞ho可以和Rho激酶、MBS相互作用，從而活化Rho激酶并使MBS轉(zhuǎn)位?；罨腞ho激酶隨后使MBS磷酸化，由此使肌球蛋白磷酸酶失活[50]。Rho激酶本身也可以在MLCK磷酸化MLC的同一位點將MLC磷酸化，從而在體外環(huán)境激活肌球蛋白的ATP酶[49]?；罨腞ho激酶增強了MLC的磷酸化從而誘導(dǎo)平滑肌收縮[51]。目前研究[46]認為，Rho激酶通過調(diào)節(jié)平滑肌對Ca2+的敏感性而誘導(dǎo)平滑肌收縮。小型豬冠狀動脈痙攣處的Rho/Rho激酶在mRNA、蛋白質(zhì)和分子活性水平均顯著上調(diào)[52]，然而采用特異性抑制劑抑制Rho激酶活性后，冠狀動脈痙攣可顯著減少[53]。

2.2.3 ERS對冠狀動脈痙攣的作用

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細胞器。ERS是指在缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及鈣離子穩(wěn)態(tài)等失衡情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)明顯增多，當(dāng)超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時，將激活轉(zhuǎn)錄活化因子 6（transcription factor 6，ATF6）通路、肌醇依賴酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）通路和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）通路[54]，通過一系列相關(guān)信號級聯(lián)反應(yīng)，來幫助細胞應(yīng)對條件的變化和維持自身穩(wěn)態(tài)。ERS直接影響應(yīng)激細胞的轉(zhuǎn)歸，如適應(yīng)、損傷或凋亡[55]。

研究[56]發(fā)現(xiàn)，ERS抑制劑?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA）作用于自發(fā)性高血壓性大鼠后，冠狀動脈的肌張力恢復(fù)正常。采用另一種ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）連續(xù)腹腔注射1周后，發(fā)現(xiàn)小鼠右心室收縮壓下降30%，右心室肥厚和肺動脈肌化得到顯著改善[57]。進一步研究[58]揭示，血管平滑肌細胞內(nèi)異常的ERS導(dǎo)致了主動脈血管收縮反應(yīng)性增高，引起血壓升高。ERS被干擾后，血管平滑肌細胞收縮性顯著下降。同時ERS對主動脈收縮反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用不依賴于內(nèi)皮細胞[58]。此外，ERS的IRE1通路與肌球蛋白ⅡB有關(guān)。肌球蛋白ⅡB通過促進MLC2磷酸化，介導(dǎo)了IRE1α的聚集[59]。ERS激活后，伴隨MLC的磷酸化增多[58]?？梢?，ERS是血管收縮的重要因素。

3 展 望

表1 各種分子對冠狀動脈痙攣的影響

冠狀動脈痙攣目前被認為是一種由多分子通路介導(dǎo)的急性冠狀動脈綜合征（表1）。一方面，血管內(nèi)皮細胞所釋放的血管收縮因子和血管舒張因子的動態(tài)平衡，是調(diào)控血管張力的重要機制，一旦平衡被打破，如一氧化氮釋放減少或ET-1釋放增加，將導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，增加冠狀動脈痙攣的發(fā)生風(fēng)險。另一方面，血管平滑肌細胞是血管收縮的直接執(zhí)行者，其對血管張力的調(diào)控至關(guān)重要。當(dāng)血管平滑肌細胞發(fā)生MLC磷酸化、Rho激酶功能異常以及ERS時，血管平滑肌細胞對鈣離子處于高度敏感狀態(tài)，冠狀動脈痙攣的發(fā)生率大為增高。

在法醫(yī)病理學(xué)鑒定實踐中，部分心臟性猝死的案例尸體檢驗時無明顯的形態(tài)學(xué)改變或病變較輕（如冠狀動脈粥樣硬化，管腔狹窄Ⅰ～Ⅱ級），同時還存在部分青壯年猝死綜合征的案例，其死因也高度懷疑為心源性疾病，是法醫(yī)學(xué)鑒定中的難點。在猝死疾病中，若冠狀動脈粥樣硬化伴隨管腔狹窄Ⅲ級或以上，在排除其他死亡原因后，可作出冠狀動脈粥樣硬化性心臟病死亡的病理診斷。然而，很多猝死的案例在系統(tǒng)解剖后僅可見冠狀動脈輕微病變，管腔狹窄程度低于Ⅱ級。針對這部分案例，有學(xué)者[65]建議，如果死者生前存在明顯誘因（如與人爭執(zhí)、寒冷刺激等），則高度懷疑為生前冠狀動脈痙攣導(dǎo)致死亡，但法醫(yī)病理學(xué)鑒定中缺乏有效檢測手段。FACTOR等[66]最先發(fā)現(xiàn)在63例無明顯陽性改變的心臟中，47例（74.6%）案例的冠狀動脈中膜層出現(xiàn)明顯的血管平滑肌收縮帶，并且在這47例心臟中，78.7%高度懷疑為冠狀動脈痙攣致死。鑒于血管平滑肌收縮帶與冠狀動脈痙攣的高度相關(guān)性，F(xiàn)ACTOR等[66]提出平滑肌收縮帶可作為診斷生前冠狀動脈痙攣的重要指標(biāo)。與非冠狀動脈疾病相比，內(nèi)彈力膜和內(nèi)膜折疊度也被發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈痙攣后顯著改變[67]。此外，LIN等[68]發(fā)現(xiàn)血管平滑肌強直痙攣可伴隨其他形態(tài)學(xué)改變，包括細胞縱向短縮，胞核縮窄、重疊等，并提出這些形態(tài)學(xué)改變可用于診斷冠狀動脈痙攣。這些重要的形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)推動了冠狀動脈痙攣研究的進展，然而基于形態(tài)學(xué)的觀察存在主觀性和觀察者的判斷差異性。實際檢案中，某些案例依舊只能依靠推測，判斷冠狀動脈痙攣導(dǎo)致心臟性猝死，結(jié)論往往容易引起爭議[69]。研究[10，32，60-62]發(fā)現(xiàn)，一氧化氮、ET-1、磷酸化的MLC、Rho激酶和ERS等與冠狀動脈痙攣存在密切關(guān)系（表1）。其中，磷酸化的MLC和Rho激酶在冠狀動脈平滑肌細胞中的表達水平升高，可用于預(yù)測急性心肌梗死等疾病。此外，在血液中篩選和鑒定一氧化氮和ET-1理論上是可行的，并且有研究[32，60-62]證實二者在血液中的水平對部分心血管疾病有預(yù)測意義?？紤]到司法實踐中組織樣本不易保存和攜帶，易受腐敗影響，而血液方便存取，在瀕死期由醫(yī)療機構(gòu)或死亡早期由司法鑒定人員抽取、保存更為容易，因此一氧化氮和ET-1有望成為潛在的冠狀動脈痙攣診斷指標(biāo)。對于上述分子與冠狀動脈痙攣的關(guān)系的探討，需要更多的科學(xué)研究加以佐證，屆時將其應(yīng)用于高度懷疑冠狀動脈痙攣致死的案件中，為法醫(yī)工作者診斷冠狀動脈痙攣提供輔助依據(jù)。

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