顧憲文,谷蘭海,邢加強,李殿波,于海防

(山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院胸外科 276000)

非小細胞肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，病死率居各類惡性腫瘤的首位，近年發(fā)病率呈上升趨勢，患者預(yù)后差，5年存活率僅為13%[1]。目前臨床上對非小細胞肺癌主要采用鉑類化療藥物進行治療，長期大劑量應(yīng)用鉑類化療藥物可增加患者耐藥性，降低化療敏感性[2]。因此，尋找有效的治療方案對改善非小細胞肺癌患者預(yù)后，提高患者存活率有重要的意義。阿司匹林屬于非甾體抗炎藥物，可通過抑制環(huán)氧化酶活性而影響機體多種生理病理性活動[3]。文獻[4]指出，阿司匹林可抑制多種腫瘤細胞增殖及生長，如肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌等。關(guān)云哲等[5]研究指出，長期服用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物能有效降低惡性腫瘤發(fā)生率。相關(guān)流行病學證實，非甾體類抗炎藥物能有效降低結(jié)直腸癌發(fā)生率，可恢復(fù)機體抗腫瘤免疫功能[6]。本研究通過體外細胞培養(yǎng)探討阿司匹林抑制非小細胞肺癌A549增殖及凋亡的作用機制，旨在為非小細胞肺癌臨床預(yù)防及治療提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 非小細胞肺癌A549細胞(湖南豐暉生物科技有限公司)；新生胎牛血清(上海恒遠生物有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(上海博升生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT，上海滬峰化工有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海伊卡生物技術(shù)有限公司)。

1.2儀器與試劑 光學顯微鏡(型號DMLP-MP30；上海光學儀器廠)；微量移液器(20、200、1000 μL；DragonMed公司)；臺式微量離心機(型號H1650-W；北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；高速冷凍離心機(型號A1330103；太倉市華美生化儀器廠)；臺式低溫高速離心機(型號TD-35M/TD35；上海珂淮儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號MCO-20AIC；上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)；電子天平(BP211D型；Sartorius公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(型號DNM-9602G型；北京普朗新技術(shù)有限公司)；流式細胞儀(型號1401-X-20R；貝克曼庫爾特有限公司)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)；表皮生長因子受體(EGFR)試劑盒(北京雅康博生物科技有限公司)；成纖維細胞生長因子(FGF)試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。兔抗人VEGF克隆抗體、兔抗人EGFR克隆抗體、兔抗人FGF抗體均購于美國Santa Gruz生物公司，阿司匹林購于河南福森藥業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1非小細胞肺癌A549的培養(yǎng) 取非小細胞肺癌A549細胞，在無菌操作條件下置于含10%胎牛血清(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)RPMI1640培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，傳代時依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，反復(fù)消化直至組織塊消失。收集懸浮液，離心過濾后留取沉淀物，繼續(xù)傳代培養(yǎng)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，每次傳代2～4 d，收集對數(shù)生長期細胞，每種實驗重復(fù)3次。

1.3.2倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 在6孔培養(yǎng)板中接種非小細胞肺癌A549細胞1×105個/孔，分別加入阿司匹林2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，將等體積生理鹽水加入對照組，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，后應(yīng)用倒置顯微鏡下細胞形態(tài)。

1.3.3噻唑藍(MTT)法測定細胞生長抑制率 在96孔板中接種對數(shù)期非小細胞肺癌A549細胞1×104個/孔，將新生胎牛血清100 μL分別加入孔中，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加藥，分別加入阿司匹林2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，將等體積生理鹽水加入對照組，加入培養(yǎng)基，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，分別加入5 g/L MTT溶液20 μL，待培養(yǎng)24、48、72 h后，繼續(xù)恒溫孵育4 h，將培養(yǎng)液去掉，依次加入經(jīng)生物素標記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用酶標儀測量樣品在570 nm處吸光度，并計算生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。

1.3.4非小細胞肺癌A549細胞凋亡率測定 應(yīng)用0.25%胰酶消化細胞制備懸液，在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)對數(shù)生長期非小細胞肺癌A549細胞1×105個/孔。分別加入阿司匹林2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，將等體積生理鹽水加入對照組，加入培養(yǎng)基，收集細胞于作用24 h后。采用70%乙醇固定細胞，行 Annexin V/PI雙染色，具體操作：取10萬個細胞，離心5 min，棄去上清液，加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細胞，室溫下避光孵育10 min，離心處理5 min后加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴下避光放置10 min后上機使用流式細胞儀測定細胞凋亡率，重復(fù)操作3次。

1.3.5Western blot法測定相關(guān)蛋白 分別在10 mmol/L阿司匹林作用A549細胞24、48 h后加入細胞裂解液，并于低溫下高速離心30 min，收集上清液，加入考馬斯亮藍染色，酶標儀測定蛋白水平，并置于沸水中加熱5 min破壞蛋白結(jié)構(gòu)，加入10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入兔抗人VEGF克隆抗體、兔抗人EGFR隆抗體、兔抗人FGF抗體，TBST洗滌2次，ECL顯影壓片。

2 結(jié) 果

2.1阿司匹林作用非小細胞肺癌A549細胞形態(tài)學觀察 在倒置顯微鏡下觀察10.0 mmol/L阿司匹林作用非小細胞肺癌A549 48 h后，細胞呈通透性增加，形態(tài)不規(guī)則，細胞脫落、破碎等改變。見圖1。

注：A為對照組非小細胞肺癌A549細胞形態(tài)學表現(xiàn)；B為10.0 mmol/L阿司匹林作用非小細胞肺癌A549 48 h后細胞形態(tài)學表現(xiàn)

圖1阿司匹林作用非小細胞肺癌A549細胞形態(tài)學觀察

2.2阿司匹林對非小細胞肺癌A549細胞增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示，阿司匹林可抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖，且呈劑量及時間依賴性。見表1。

表1 阿司匹林對非小細胞肺癌A549細胞的生長抑制率

注：與24 h相比，*P<0.05；與48 h相比，#P<0.05；-表示無數(shù)據(jù)

2.3阿司匹林誘導(dǎo)非小細胞肺癌A549細胞凋亡 未經(jīng)處理的非小細胞肺癌A549細胞處于G0/G1期的高達60%，較少處于凋亡期。經(jīng)阿司匹林處理后，A549細胞處于G0/G1期數(shù)量明顯減少，而處于S期的細胞數(shù)明顯增加。隨著藥物水平增加，細胞周期改變，大部分細胞在S期發(fā)生凋亡，凋亡率呈時間及劑量依賴性。見表2。

表2 阿司匹林作用非小細胞肺癌A549細胞48 h后各周期細胞凋亡率

注：與0.0 mmol/L阿司匹林比較，*P<0.05

2.4阿司匹林抑制腫瘤VEGF、EGFR、FGF蛋白表達 阿司匹林作用A549細胞后VEGF、EGFR、FGF蛋白表達水平明顯下降，且呈劑量依賴性，提示阿司匹林抑制A549細胞凋亡的機制可能與其抑制血管相關(guān)生成因子表達，影響腫瘤新生血管生成有關(guān)。見圖2。

圖2 阿司匹林抑制腫瘤VEGF、EGFR、FGF蛋白表達

3 討 論

化療是目前治療非小細胞肺癌的重要手段，但大部分化療藥物會產(chǎn)生不良反應(yīng)，影響患者化療依從性[7]。此外，長期應(yīng)用同一種化療藥物治療容易導(dǎo)致機體產(chǎn)生耐藥性，影響化療效果。因此，尋找安全有效的抗腫瘤治療方案對改善非小細胞肺癌患者預(yù)后，提高患者存活率具有積極的作用。阿司匹林屬于非甾類藥物，近年研究表明，阿司匹林在抗腫瘤治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。劉宇等[9]通過大樣本對照研究發(fā)現(xiàn)，慢性胃潰瘍患者中服用過阿司匹林的患者其胃癌發(fā)生率明顯低于未服用過阿司匹林者，經(jīng)年齡、性別及社會因素校正后，提示服用阿司匹林可將胃癌風險明顯降低，且隨著用藥頻率的增加，風險進一步降低。LICHTENBERGER等[10]研究指出，阿司匹林不僅能降低多種惡性腫瘤的發(fā)生率，而且還可通過抑制糖原合成酶激酶-3β及其下游基因產(chǎn)物活性，達到吉西他濱促進胰腺癌細胞凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠?qū)Ψ切〖毎伟〢549細胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，使細胞活性降低，將細胞阻滯在DNA合成的S期，從而有效誘導(dǎo)細胞凋亡，并呈時間及劑量依賴性。

腫瘤的生成、增殖及轉(zhuǎn)移過程伴隨著血管的生成，腫瘤血管生成過程包括內(nèi)皮細胞遷移、增殖、管狀結(jié)構(gòu)形成及血流貫通等步驟，而在這個過程中血管生成相關(guān)因子起到重要的作用[11]。目前研究指出，VEGF、EGFR、FGF等多種因子在腫瘤血管生成中起到重要的調(diào)節(jié)作用[12]。VEGF是最強的促血管生成因子，可與血管內(nèi)皮細胞表面受體結(jié)合，并增加血管通透性，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移。同時VEGF可激活PI3K/Akt信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，并誘導(dǎo)血管生成，促進腫脹形成。阿司匹林能夠抑制原癌基因ErbB2的表達，進而抑制其下游細胞VEGF信號通路表達，抑制此信號通路在阿司匹林誘導(dǎo)的血管新生中起重要作用。EGFR屬于酪氨酸激酶型受體，可參與細胞增殖及血管生成[13]。HENRY等[14]研究指出，EGFR可介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與腫瘤進展，促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。研究指出，阿司匹林的抗腫瘤作用機制主要與抑制EGFR的表達有關(guān)，阿司匹林對胃癌的抑制作用主要與其抑制EGFR的表達有關(guān)[15]。FGF由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞分泌。它的作用是促進內(nèi)皮細胞的游走和平滑肌細胞的增殖，能夠修復(fù)損傷的內(nèi)皮細胞及促進新血管形成。因此，通過下調(diào)非小細胞肺癌患者腫瘤細胞中VEGF、EGFR、FGF表達將有助于抑制腫瘤的生成。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林作用A549細胞后VEGF、EGFR、FGF表達水平顯著下降，且呈劑量依賴性，提示阿司匹林抑制A549細胞凋亡的機制可能與其抑制血管相關(guān)生成因子表達，影響腫瘤新生血管生成有關(guān)。

綜上所述，阿司匹林可抑制非小細胞肺癌A549細胞體外增殖，誘導(dǎo)細胞在S期凋亡，其凋亡機制可能與阿司匹林可抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子表達有關(guān)。

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