唐秀華，周喆，唐琴，陳佳佳，謝鳳，洪瑤新，黃詩林，陳志丹,3,4*，孫威江1,,3,4*

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茶樹3基因cDNA全長克隆及其表達分析

唐秀華1,3,4，周喆1,3,4，唐琴1,3,4，陳佳佳1,3,4，謝鳳1,3,4，洪瑤新1,3,4，黃詩林2，陳志丹2,3,4*，孫威江1,2,3,4*

1. 福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學安溪茶學院，福建 泉州 362400；3. 福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心，福建 福州 350002；4. 福建茶產(chǎn)業(yè)技術開發(fā)基地，福建 福州 350002

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）由多基因家族編碼，是花青素等多酚物質合成途徑的起始酶，對其合成具有調控作用。本研究以紫化茶樹武夷奇種C18茶樹為材料，采用RACE技術克隆獲得基因cDNA，命名為3（登錄號為KY865305），分析其生物信息學特征，并檢測不同葉色茶樹品種（系）中的花青素總量及茶樹PAL家族成員基因的表達情況。結果表明，獲得3基因全長cDNA為2?518?bp，包含一個完整的2?130?bp開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），編碼709個氨基酸。序列分析表明，該基因編碼的蛋白質為穩(wěn)定親水性蛋白，預測分子量為77.40?kD，理論等電點為6.26；Blast分析序列發(fā)現(xiàn)3與芒果的相似性最高，為87%。而在同源進化樹分析中與芍藥的親緣關系較近。紫化茶樹的花青素總量和a、c、3（e）基因表達量均高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹。這表明茶樹a、c、3（e）基因上調表達可能促進茶樹花青素合成積累，使得茶樹葉片呈現(xiàn)紫色。

茶樹；3基因；克?。幌鄬Ρ磉_量；花青素

花青素（）屬于水溶性色素，不穩(wěn)定，需要與糖苷配基組成花青苷，以糖苷的形式存在于液泡中?；ㄇ嗨睾铣赏緩?，第1階段以苯丙氨酸為底物，由、和4上游結構基因共同催化完成；第2階段以香豆酰CoA為底物，由、、中游結構基因共同催化完成；第3階段以二氫黃酮醇為底物，由、（）和下游結構基因共同催化完成[1]。其中是花青素合成的起始酶，也是限速酶，即代謝過程中催化反應速度最慢的酶，亦可改變代謝方向。基因是由多基因家族編碼，合成中間產(chǎn)物4-香豆酰輔酶A，參與植物形成次級代謝產(chǎn)物，如花青素、兒茶素、木質素等多種類黃酮化合物。

近年來，對植物基因的研究從酶提取、測定活性過渡到抗逆性、基因克隆和表達量分析等方面。目前，多種植物中的基因已被鑒定并進行更深入的研究。2011年以來，相繼從水稻[2]、甘蔗[3]、美洲南瓜[4-5]、鴨梨[6]、小麥[7]、李子[8]等經(jīng)濟作物中克隆基因cDNA全長并進行生物信息學分析。在茶樹（）上，從生理生化、分子生物學等不同水平上對武夷奇種紫化茶樹進行相關研究[9-11]，表明紫紅色的嫩梢中花青素總量顯著高于綠色的成熟葉，且基因表達量顯著高于成熟綠葉，但茶樹基因cDNA全長克隆及其序列分析還未見報道。

芽葉紫化茶樹作為一種優(yōu)異茶樹種質資源而廣為人知，在生產(chǎn)實際中也因獨特的功能性和品質特征而有較大的應用價值。茶樹基因與芽葉紫化性狀調控顯著相關，發(fā)掘和鑒定茶樹基因對研究茶樹芽葉色澤形成和高花青素含量的調控機制具有重要意義。本研究首次克隆了茶樹L3基因的全長序列，對L3基因的基本生物信息學特征進行分析，并探究花青素總量和茶樹PAL家族成員基因在不同葉色茶樹葉片中的表達規(guī)律，為進一步研究L3基因調控高花青素的芽葉紫化茶樹的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自武夷星茶業(yè)有限公司種質資源圃，于2016年秋季采摘紫化茶樹武夷奇種C18的第1葉位葉片，按照五點采樣法混合均勻后迅速用液氮冷凍，置–80℃冰箱保存，用于基因克隆。于2017年夏季采摘常規(guī)綠葉茶樹朝陽、水仙和武夷奇種83，紫化茶樹武夷奇種和武夷奇種73，白化茶樹白雞冠和御金香，共7份，取各茶樹品種（系）生長發(fā)育良好、形狀大小一致的第2葉位葉片，每個品種（系）設置3個生物學重復，樣品用液氮速凍，用于實時熒光定量PCR檢測，如圖1。

1.2 茶樹總RNA的提取及cDNA的合成

參考OMEGA植物總RNA提取試劑盒的說明書提取上述各茶樹品種（系）樣品的總RNA，采用RNase-Free DNase I Set試劑盒（OMEGA）消除基因組DNA，采用超微量分光光度計（賽默飛，NanoDrop 2000c）測定各RNA濃度，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測各RNA的完整性，于–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Promega GoScript反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.3 茶樹CsPAL3基因的全長cDNA克隆及驗證

參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit（Clontech）試劑盒說明書的方法分別合成5′/3′RACE-Ready cDNA。參考GenBank上已登錄的茶樹、葡萄、荷花、胡蘿卜、棗等基因的保守序列，使用DNAMAN設計引物（表1）。根據(jù)試劑盒說明書進行加樣和5′/3′RACE的巢式PCR擴增，切膠回收，連接至載體pMD19-T(TaKaRa)，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109(TaKaRa)，37℃培養(yǎng)過夜。通過藍白斑篩選與菌落PCR鑒定，挑取陽性單菌落，送至華大基因測序。

根據(jù)上述3段序列進行拼接，在其編碼區(qū)的兩端設計引物-F和-R，用高保真酶Prime STAR? GXL DNA Polymerase進行PCR擴增編碼區(qū)片段，反應條件為：98℃預變性4?min；98℃、10?s，56℃、15?s，68℃、135?s，共30循環(huán)；最后68℃延伸10?min。切膠回收，連接至載體pEASY-Blunt Zero（全式金生物），轉化大腸桿菌DH5α (TaKaRa)，于37℃過夜培養(yǎng)，鑒定陽性克隆，送至華大基因測序，驗證3的cDNA全長序列。

1.4 茶樹CsPAL3基因的生物學信息分析

通過ProtParam軟件預測茶樹3蛋白的一級結構，GOR IV軟件預測其二級結構，SWISSMODEL軟件預測其三級結構；通過TMHMM和TMPred軟件進行蛋白質跨膜結構的預測；通過SignalP 4.1 Server軟件預測茶樹3基因編碼氨基酸的信號肽；通過FoldIndex軟件預測該蛋白無序化程度；通過NetPhos 3.1 Server對3進行磷酸化位點進行預測；通過ProtScale進行預測其疏水性/親水性；通過PSORT II Prediction軟件預測茶樹3基因的亞細胞定位；運用MEGA6.0軟件中的近鄰相接法（Neighbor-Joining, NJ）（1000 BootStrap）構建3基因同源進化樹。

注：1：朝陽，2：水仙，3：武夷奇種83，4：武夷奇種C18，5：武夷奇種73，6：白雞冠，7：御金香。

1.5 不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量的檢測

參照文獻[9]方法提取不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量。在紫外分光光度計下分別檢測530?nm和657?nm處的吸光度值，根據(jù)公式計算茶樹花青素總量（干物重），OD/g=(OD530－0.25×OD657)/M。

1.6 茶樹PAL基因家族成員的表達分析

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 茶樹CsPAL3基因的全長cDNA克隆

采用SMART RACE技術，擴增得到1?580?bp的中間產(chǎn)物、1?696?bp的5′RACE產(chǎn)物和1?388?bp的3′RACE產(chǎn)物。通過拼接得到2?518?bp的茶樹3基因的全長cDNA序列。經(jīng)過高保真酶擴增，克隆測序，得到大小為2?130?bp的ORF片段，編碼709個氨基酸，見圖2和圖3。

2.2 茶樹CsPAL3基因的生物學信息分析

該蛋白含有保守功能結構域PLNO2457，屬于PLNO2457超級家族。通過ProtParam在線軟件預測其理化性質，結果顯示，該蛋白質的相對分子量為77.40?kD，等電點6.26，說明該蛋白為酸性蛋白質。709個氨基酸中，Leu（11.0%），Ala（8.6%），Gly（8.2%），Glu（7.9%）的頻率較高。帶負電荷的氨基酸數(shù)（Asp+Glu）為80個，正電荷的氨基酸數(shù)（Arg+Lys）為73個。消光系數(shù)（M-1cm-1 γ=280?nm）為48?360，其不穩(wěn)定系數(shù)僅為35.34，故屬于穩(wěn)定類蛋白。其半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內為30?h，在酵母細胞內大于20?h，在大腸桿菌內大于10?h。由GOR IV軟件預測結果可知，茶樹3蛋白二級結構主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈3種常見結構組成。其中無規(guī)則卷曲占45.13%的比例，α-螺旋占44.43%的比例，延伸鏈占10.44%的比例，預測結果顯示該蛋白缺失β-螺旋結構。通過SWISSMODEL軟件預測3蛋白的三級結構，該模型與歐芹（）的蛋白匹配度最高，為83.83%。

注：M：DL2000，A：中間產(chǎn)物的菌落PCR，B：5′RACE產(chǎn)物的菌落PCR，C：3′RACE產(chǎn)物的菌落PCR，D：ORF擴增。

注：下劃線為起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，陰影部分為PAL酶特征序列。

用在線軟件TMHMM Server v.2.0和TMpred預測3蛋白的跨膜螺旋區(qū)，該蛋白在膜外，不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。用SignalP 4.1軟件預測，表明蛋白無信號肽，不是分泌蛋白。對3的ORF區(qū)域編碼的蛋白進行FoldIndex預測，結果顯示，僅有7.89%的氨基酸（56個位點）組成的結構為無序結構，說明3不是無序蛋白。在NetPhos 3.1 Server中對3進行磷酸化位點預測，如圖4顯示，該序列含有58個磷酸化位點，其中18個Thr（蘇氨酸）位點，34個Ser（絲氨酸）和6個Tyr（酪氨酸）位點。磷酸化位點約占全序列的8.2%，主要能夠被蛋白激酶C（PKC），蛋白激酶A（PKA），cdc2蛋白（cdc2）和酪蛋白激酶Ⅱ(CKII)等蛋白激酶磷酸化。通過ProtScale軟件預測分析，根據(jù)“正值為疏水性，負值為親水性，負值越大說明親水性越高”的原理，由圖5可知，3氨基酸殘基在整個區(qū)域中所表現(xiàn)的親水性要大于疏水性，而且大部分分值都處于較為低的位置，故3蛋白是偏向親水性的，為親水性蛋白。通過PSORT II Prediction在線軟件對3基因的亞細胞定位進行預測分析，結果顯示，其亞細胞定位主要分布在細胞質中。

2.3 茶樹CsPAL3蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

通過3的氨基酸同源序列比對，發(fā)現(xiàn)與最新登錄的e（登錄號為KY615672）相似性為99%，與芒果（，登錄號為KF956009）的相似性為87%，與早年登錄的1（登錄號為D26596）和2（登錄號為AY694188）相似性為80%。將茶樹3與已報道的茶樹及其他植物的蛋白序列，構建PAL氨基酸的系統(tǒng)進化樹（圖6）。結果顯示，這些植物PAL可以分為A、B兩大類，其中兩條茶樹都聚類在A類中，且與芍藥（）的關系較近。

2.4 不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量分析

圖7表明，紫化茶樹第2葉位葉片的花青素總量均顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹?？梢?，高花青素是茶樹呈紫化現(xiàn)象的主要原因。

2.5 茶樹PAL基因家族成員的表達分析

采用實時熒光定量PCR技術，分析茶樹基因家族成員在不同葉色茶樹品種（系）的表達差異。圖8顯示，朝陽和武夷奇種73中的b基因表達量均明顯高于其他品種；水仙中的d基因表達量最高；朝陽中的f基因表達量最高。紫化茶樹（武夷奇種18）a、c、3（e）基因表達量均顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹，且葉片越紫，相對表達量越高。可推測a、c、3（e）基因上調表達可能促進茶樹花青素合成與積累。

圖4 CsPAL3 磷酸化位點預測

圖5 CsPAL3 氨基酸序列親/疏水性分析

圖6 CsPAL3 氨基酸序列進化樹分析

注：1：朝陽，2：水仙，3：武夷奇種83， 4：武夷奇種C18，5：武夷奇種73， 6：白雞冠，7：御金香。下同。

圖8 CsPAL 家族成員在不同葉色茶樹品種（系）的表達

3 討論

芽葉紫化茶樹作為一種特異的茶樹種質資源，葉色呈現(xiàn)紫紅色和富含花青素是紫化茶樹的特異之處，并且高花青素含量是茶樹葉片呈紫紅色的主要原因。當、、、、、、、、等結構基因表達量上調時，可促進紫化茶樹花青素積累，紫紅色變深[1,13-14]。李智[15]研究三年生鳩坑品種茶樹在不同光照、溫度、氮素處理條件下，其花青素合成結構基因的表達情況、酶活性及花青素含量之間的變化規(guī)律。結果顯示，強光、適當?shù)蜏?、缺氮誘導等均可正向調控茶樹花青素代謝合成關鍵酶基因的高表達及花青素積累，最有效誘導茶樹花青素合成的光質是紫外光。在不同光照處理下，花青素含量與、和的酶活性及相應的基因表達趨勢一致；在不同溫度處理下，花青素含量與的酶活性及相應的基因表達趨勢一致；在缺氮處理下，花青素含量與、、、和的酶活性及相應的基因表達趨勢一致，與劉健偉[16]研究結果一致。該研究表明茶樹紫化現(xiàn)象受光照、溫度和氮素等外界環(huán)境因子影響較大，誘導或抑制調控茶樹花青素代謝合成，使得茶樹呈現(xiàn)不同葉色。

本研究采用RT-PCR和RACE技術，從茶樹中成功克隆1個編碼酶的3基因，該基因開放閱讀框為2?130?bp，編碼709個氨基酸，與其他植物的具有較高的相似性，并且含有酶特征序列。該蛋白為親水酸性蛋白質，無跨膜螺旋區(qū)，預測亞細胞定位在細胞質中，這將有助于3結構和功能的進一步研究?；ㄇ嗨乜偭吭谧匣铇淦贩N（系）中含量最高，更充分證明高花青素含量是茶樹葉片呈紫紅的主要原因。采用qPCR技術，檢測茶樹家族成員基因在不同葉色茶樹品種（系）中的表達規(guī)律。結果表明，a、c、3(e)基因表達量在紫化茶樹中表達量顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹，其中富含花青素的武夷奇種C18最高。由此可推測，a、c、3(e)基因表達量與花青素含量呈正相關，可能調控茶樹花青素合成，其他家族成員的基因表達情況未發(fā)現(xiàn)規(guī)律。這與周瓊瓊等[9]研究基因在幼嫩紫葉中相對表達量顯著高于成熟綠葉的結果一致，與周天山等[17]研究紫化茶樹各葉位中花青素含量均顯著高于對照綠葉茶樹，且基因均呈現(xiàn)上調趨勢的結果一致。聶慶娟等[18]研究不同葉色的美國紅櫨葉片，發(fā)現(xiàn)紅色葉片中，花青素含量高，酶活性高；王海偉等[19]研究不同粒色小麥籽粒，發(fā)現(xiàn)有色小麥在不同時期籽?；ㄇ嗨睾颗c活性變化趨于一致，且呈顯著正相關，表明是有色小麥籽粒花青素合成的關鍵酶；趙瑩等[20]通過低質量濃度T-2處理馬鈴薯可提高酶活性，增強苯丙烷代謝，進而促進花青素的積累。由此可推測，茶樹花青素含量可能與酶活性呈正相關的關系。張澤煌等[21]研究不同顏色果肉楊梅，發(fā)現(xiàn)是花青素合成密切相關的關鍵酶，在紅果肉中明顯上調表達；Li等[22]研究秋海棠分別在強光和低溫處理下，花青素含量均顯著上升，但在低溫處理2天時，顯著上調，之后呈下調趨勢，與強光處理的結果一致。

花青素是植物呈色的主要色素，含量高低是茶樹葉色不同的主要原因。是花青素合成的上游基因，還參與其他類黃酮物質合成，不同于僅控制花青素合成的下游基因。因此后續(xù)應該進一步克隆該基因的全長基因組序列，并獲得啟動子序列，預測啟動子核心元件及調控花青素合成相關順式元件。借助過表達或基因敲除等分子生物學技術進一步轉化驗證3的基因功能，以期培育高花青素茶樹品種，提高經(jīng)濟效益。

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Cloning and Expression Analysis of a Full Length cDNA of3 Gene in Tea Plant ()

TANG Xiuhua1,3,4, ZHOU Zhe1,3,4, TANG Qin1,3,4, CHEN Jiajia1,3,4, XIE Feng1,3,4, HONG Yaoxin1,3,4, HUANG Shilin2, CHEN Zhidan2,3,4*, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. College of Tea, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 3. Tea Industry Engineering Technology Research Center of Fujian Province, Fuzhou 350002, China; 4. Tea Industry Technology Development Base of Fujian Province, Fuzhou 350002, China

The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) belongs to a multi-gene family. PAL is the first enzyme in theflavonoid biosynthetic pathway, which plays a key role in regulating flavonoid biosynthesis. The full length cDNA sequence of one phenylalanine ammonia-lyase () gene was obtained from purple tea cultivar Wuyi Qizhong C18 () by rapid amplification of cDNA ends PCR(RACE-PCR) and named as3 (GenBank accession no. KY865305). The full-length cDNA ofwas 2?518?bp, with an ORF of 2?130?bp, which encodes a protein of 709 amino acids.Bioinformatics analysis showed it is a stable hydrophilic protein, withthe predict molecular and theoretic isoelectric points of 77.40?kD and 6.26. Blast analysis indicated that3 had the highest similarity (87%) with homologue gene in, and had the closest genetic relationship with homologue gene inaccording to phylogenetic tree analysis. The total anthocyanin contents and the expressionofa,c,3 in the purple shoots of tea plants were significantly higher than the green and white tea plants. It suggests that the enhanced expression levels ofa,c,3 genesmight promote the accumulation of anthocyanins, therebylead to the purple color in tea plants.

tea plant,3 gene, cloning, relative expression, anthocyanins

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-033-10

2017-10-16

2017-11-09

紫化芽葉茶樹種質資源的挖掘保存與創(chuàng)新利用（2015N5008）、福建省科技重大專項專題項目（2015NZ0002-1）、福建省科技重大專項專題（2017NZ0002-1）

唐秀華，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學研究。*通訊作者：swj8103@126.com; asbulletdan@163.com.