張永樂，劉會香*，許永玉，何邦令*，鄭金柱

?

圍小叢殼菌山茶?；团c葡萄座腔菌復(fù)合侵染引致茶褐枯病

張永樂1，劉會香1*，許永玉1，何邦令1*，鄭金柱2

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 27018; 2. 徂徠山林場，山東 泰安 271027

在山東日照東港區(qū)茶園茶樹葉部發(fā)現(xiàn)一種新病害。感病部位縊縮，畸形，病斑褐色，壞死，命名為茶褐枯病。取病健交界處采用組織分離法共獲得兩種微生物，編號為RC4、RC3，分離率分別為67.1%和32.9%。結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)學(xué)、多基因序列分析和柯赫氏法則驗(yàn)證，明確該病害由圍小叢殼菌山茶?；停╢.sp.）和葡萄座腔菌（）復(fù)合侵染引起。這也是首次在茶樹葉部發(fā)現(xiàn)的危害。

茶樹；葡萄座腔菌；圍小叢殼菌山茶?；?；復(fù)合侵染；鑒定

茶為山茶科木本植物茶的芽葉，具有降壓、提神、保健等功效[1]。山東省自1959年實(shí)施“南茶北引”計(jì)劃以來，現(xiàn)已成為我國最北的茶樹種植區(qū)[2]。據(jù)報道，全世界茶樹病害有380余種，我國發(fā)生普遍的約30余種[3]。常見危害葉部的病害有茶云紋葉枯?。ǎ?、茶芽枯病（Chen et Hu sp）、茶輪斑?。ǎ⒉杼烤也。╯p.）、茶赤葉斑病（Petch）、茶灰星?。℉ara）[4-6]等。隨著茶樹栽植面積的不斷擴(kuò)大和品種更換，茶樹葉部病害及病原出現(xiàn)新的變化。作者在山東省日照東港茶區(qū)茶樹葉部發(fā)現(xiàn)一種新病害，病害田間發(fā)病率達(dá)20%，對茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定的影響，本文在病害癥狀描述的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對病原菌進(jìn)行了分離、鑒定及致病性測定，明確了病原菌的分類地位，研究結(jié)果為病害的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 癥狀觀察

2016年8月，在日照東港區(qū)厲家頂子村瑜山茶場（35°46′N，119°42′E）調(diào)查茶褐枯病危害，記錄病害癥狀，觀察病斑危害部位，顏色、形狀，測量病斑大小[7]。并將具典型癥狀的病葉采集，用于室內(nèi)分離。

1.2病原菌分離純化

參照方中達(dá)組織分離法[8]分離病健組織，置于PDA培養(yǎng)基28℃下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。樣品重復(fù)30次，統(tǒng)計(jì)分離出的兩種微生物比例，并編號為RC4和RC3，相同條件下繼續(xù)純化培養(yǎng)。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察

逐日觀察微生物在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及顏色變化，在3、5、8?d時用十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算生長速度。

待RC4培養(yǎng)4?d后回接到葉片，繼續(xù)培養(yǎng)10?d至產(chǎn)生橘紅色孢子堆，鏡檢其顯微特征，無菌水將分生孢子配成懸浮液，取60?μL懸浮液滴于凹載玻片上28℃黑暗條件下培養(yǎng)12?h后[9]，觀察附著孢的形態(tài)和大小。

待培養(yǎng)7?d后，在RC3菌落邊緣取直徑為7?mm的菌餅轉(zhuǎn)接至松樹煎汁培養(yǎng)基[10]，培養(yǎng)至產(chǎn)生子實(shí)體，顯微觀察分生孢子器和分生孢子形態(tài)特征。

1.3.2菌絲收集及DNA的提取

取PDA培養(yǎng)6?d的菌絲，采用2×CTAB[11]法提取菌株總DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增與序列測定

以RC4總DNA為模板，對和基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以RC3總DNA為模板，對和基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物序列、退火溫度見表1。每個反應(yīng)體系總體積均為40?μL，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從NCBI的BLAST程序GenBank數(shù)據(jù)庫中下載模式菌株序列為參考，與供試菌株采用Mega5.1中ClustalW進(jìn)行比對，菌株RC3以[16]為外源序列，各基因序列剪切后以的順序拼接。選擇作為菌株RC4的外源序列，以的順序首尾拼接，自展法（Bootstrap）檢測，重復(fù)1?000次，構(gòu)建鄰接樹（Neighbor- Joining Tree）。

1.5 致病性測定

對兩株真菌分別接種和混合接種。選取新鮮的成熟健康茶樹葉片，用75%酒精表面消毒，葉基部用脫脂棉保濕。單接直接選取直徑7?mm菌絲塊進(jìn)行刺傷和無傷接種[17]?；旌辖臃N選取貼有纖維素膜培養(yǎng)7?d的菌落，揭膜剪碎菌絲等比例混合，用7?mm打孔器分割后，分別接種于主脈兩側(cè)，作為有傷接種點(diǎn)和無傷接種點(diǎn)，葉尖部接種PDA培養(yǎng)基作為對照，其余部位接種供試菌株，每個處理重復(fù)8個葉片。處理后的葉片置于內(nèi)有2層紗布的無菌培養(yǎng)皿中，于28℃、濕度95%、12?h光暗交替的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[18]，定期觀察病斑擴(kuò)展特點(diǎn)。待發(fā)病后再次進(jìn)行組織分離、培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)及子實(shí)體特征，并與原菌株進(jìn)行對比。

表1 本研究所用的引物及擴(kuò)增條件

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察

該病害發(fā)病初期，病斑部位呈褐色點(diǎn)狀，后病斑擴(kuò)大成片，病健交界明顯，病斑部位明顯縊縮（圖1-A、圖1-B），畸形。病斑蔓延迅速，最后導(dǎo)致葉片壞死（圖1-C）。

2.2 病原菌分離結(jié)果

共分離到2種微生物，編號分別為RC4（分離率67.1%）和RC3（分離率32.9%）。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 菌落和子實(shí)體形態(tài)特征

菌株RC4在PDA培養(yǎng)基上菌絲呈絨毛狀，邊緣白色，中間隆起并有黑色素沉積，背面可見灰色環(huán)狀物，生長速度12.3?mm·d-1（圖2-A，圖2-B）。分生孢子盤狀埋生于葉片表皮下，黑褐色或無色，盤狀，底部扁平或稍凹陷，周生黑色剛毛。分生孢子梗無色短線狀，單根，頂生一個分生孢子。分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，大小為(19.7±0.7)?μm×(5.4±0.6)?μm（圖2-C，圖2-D）。附著胞黑褐色，橢圓形或不規(guī)則形，大小為(8.7±0.7)?μm×(5.8±0.8)?μm（圖2-E）。根據(jù)菌落形態(tài)及子實(shí)體特征，初步鑒定其為炭疽菌（sp.）。

分離純化的菌株RC3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為白色，5~6?d變?yōu)榛疑?5?d后變?yōu)楹谏z生長迅速（24.3?mm·d-1），氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈棉絮狀（圖3-A）。在松樹煎汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)29?d后，產(chǎn)生黑色圓球形分生孢子器，單腔室（圖3-B）。分生孢子紡錘形或長橢圓形，單胞，無色（圖3-C），大小為(15.1~28.1)?μm×(4.7~7.9)?μm。根據(jù)菌落形態(tài)及子實(shí)體特征，初步鑒定其為葡萄座腔菌。

2.3.2 病菌分類地位及系統(tǒng)樹構(gòu)建

多基因系統(tǒng)樹顯示（圖4），RC4菌株與炭疽菌有性階段圍小叢殼菌山茶專化型（f. sp.）模式株ICMP10643聚為一枝，且支持率為87%，外源序列獨(dú)立成族。

供試菌株RC3與參考菌株分為三大族（圖5），和供試菌株遺傳距離較近，組成第Ⅰ族，RC3與模式菌株DA21111、CMW9075聚為一枝，置信率為99%；第Ⅱ族由與組成；外源序列獨(dú)立成簇，形成第Ⅲ族。

結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，從茶樹病葉上分離的真菌菌株RC3為葡萄座腔菌（）。RC4為圍小叢殼菌山茶?；停℅.f. sp.）。

注：A：早期正面癥狀，B：早期背面癥狀，C：晚期癥狀。

注：A：菌落正面特征，B：菌落背面特征，C~D：分生孢子器結(jié)構(gòu)，E：分生孢子和附著胞形態(tài)。

注：A：PDA 上菌落正面特征，B：菌落背面特征，C：子實(shí)體結(jié)構(gòu)，D：分生孢子形態(tài)。

圖4 RC4基于ITS-CHS-1-GAPDH-ACT-β-tubulin基因合并序列NJ炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 致病性測定

菌株RC3傷口接種發(fā)病率達(dá)86.7%。葉片接種第5天開始發(fā)病，第8天時測得病斑直徑為0.6~1.7?cm（圖6-a2，圖6-b2）。接種RC4的有傷口接種點(diǎn)第3天開始發(fā)病，第8天時發(fā)病率達(dá)100%，病斑直徑2.1~2.8?cm，并產(chǎn)生橘紅色孢子堆。混合接種的30個接種點(diǎn)，傷口接種發(fā)病率同為86.7%，第8天病斑直徑2.1~3.0?cm。繼續(xù)進(jìn)行接種感病組織的分離培養(yǎng)，獲得和原接種相同的病菌。而無傷接種（圖6-a1，圖6-b1）和對照（圖6-c1，圖6-c2）均未發(fā)病，說明葡萄座腔菌和炭疽菌可通過傷口侵染茶樹葉片，符合柯赫氏法則，說明茶葉褐枯病由葡萄座腔菌和炭疽菌復(fù)合侵染所致。

根據(jù)病原菌的分離率和回接發(fā)病歷程，炭疽菌RC4侵染能力強(qiáng)，在茶樹葉片上優(yōu)先定殖于寄主組織，是引起病害的主要病原。葡萄座腔菌RC3致病性較弱，病斑擴(kuò)展慢，是次要病原菌。

圖5 RC3 基于ITS-EF-1α-β-tubulin 基因合并序列NJ 葡萄座腔菌系統(tǒng)發(fā)育樹

注：A：接種RC3，B：接種RC4，C：同時接種；a1、b1：無傷接種病原菌，a2、b2：有傷口接種病原菌，c1：無傷接種PDA，c2：有傷接種PDA。

3 結(jié)論與討論

由圍小叢殼菌山茶?；秃推咸炎痪鷱?fù)合侵染引起的茶褐枯病目前尚未見報道。本研究從日照東港區(qū)瑜山茶場疑似褐枯病的茶樹葉片中分離到兩種真菌，采用培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)、多基因序列分析和柯赫氏法則，證實(shí)圍小叢殼菌山茶專化型與葡萄座腔菌復(fù)合侵染引致茶葉褐枯病。炭疽菌危害寄主廣泛，為害茶樹葉部已有很多研究[1]，但與葡萄座腔菌復(fù)合侵染茶樹葉部為首次報道。

葡萄座腔菌是一類全球性分布的農(nóng)林業(yè)重要病原菌[19-20]，又可作為內(nèi)生菌寄生于植物組織內(nèi)部，同時可寄生于一些衰弱的植物組織上引起枝干潰瘍、干腐、流膠及果實(shí)腐爛等癥狀，如楊樹潰瘍病、蘋果輪紋病和桃流膠病等[21-25]，但危害茶樹葉部為首次發(fā)現(xiàn)。

本次調(diào)查的瑜山茶場管理粗放，雜草較多，病株殘體未及時清理，可作為葡萄座腔菌的寄主來源；炭疽病發(fā)生普遍，成為該病害主要侵染源。另外，植株種植密度較大，通風(fēng)不良，高溫高濕，為兩種病原菌的侵染提供了合適的生態(tài)環(huán)境條件。兩種病原菌通過機(jī)械傷口侵入，雨水傳播，因此在修枝整形時要避免雨季，對傷口實(shí)施必要的防護(hù)。炭疽病菌作為一個優(yōu)勢菌，其與葡萄座腔菌在病害中的各自作用機(jī)制尚需繼續(xù)探討。實(shí)際生產(chǎn)中，病原復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍，復(fù)合侵染過程與病原菌種類和致病力強(qiáng)弱、寄主植株生理階段、抗感性和環(huán)境條件密切相關(guān)[26]，正確認(rèn)識病原菌間的相互作用規(guī)律，對病害的綜合防治具有重要指導(dǎo)意義。

[1] 肖強(qiáng). 茶樹病蟲害綠色防控技術(shù)與專業(yè)化防治模式[J]. 中國茶葉, 2012(5): 20-23.

[2] 謝思惠, 張麗霞, 劉峰, 等. 山東茶葉發(fā)展現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J]. 山東林業(yè)科技, 2007, 170 (3): 104-107.

[3] 孫曉玲.中國重要茶樹葉部病害的研究現(xiàn)狀及展望[J].中國茶葉,2016, 12(12): 12-15.

[4] 詹三良. 皖南茶區(qū)三種主要病害發(fā)生及防治初探[J]. 茶葉通報, 2016(4): 175-176.

[5] 張強(qiáng), 楊云祥, 唐方圓, 等. 茶樹主要病害及防治措施研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)信息, 2015, 6: 80-81.

[6] 戚利潮, 張葉大. 茶樹主要病害及其防治[J]. 茶葉, 2016, 42(1): 10-12.

[7] 蒲國濤, 張錫友, 胡春學(xué), 等. 漢中市城固縣茶園病害調(diào)查及防治對策[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014(7): 82-85.

[8] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 122-145.

[9] 湯銥泠, 周國英, 李河, 等. 多基因序列鑒定油茶炭疽病原新種[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2015, 36(5): 972-977.

[10] 姚晟偉, 謝悅, 李興紅. 葡萄潰瘍病病菌的誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法評價[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2011(9): 4-7.

[11] 劉威, 陳玉森, 劉偉, 等. 茶樹炭疽病的病原鑒定及其生物特性的研究[J]. 寧德師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 25(1): 1-5.

[12] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]//Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press, 1990: 315-322.

[13] Glass NL, Donaldson GC. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes [J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61: 1323-1330.

[14] Weir B S, Johnston P R, Damm U. Thespecies complex [J]. Studies in Mycology, 2012, 73(1): 115-180.

[15] Carbone I, Kohn LM. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia, 1999, 91: 553-556.

[16] 王璠. 桃流膠病菌spp.鑒定、分布、遺傳多樣性及PCR快速檢測技術(shù)研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[17] 劉威, 袁丁, 葉乃興, 等. 茶樹炭疽病病原鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)報, 2017, 48(3): 448-453.

[18] 姜曉龍, 金磊磊, 陳輝輝, 等. 1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(2): 319-322.

[19] Slipper B, Wingfield M J.as endophytes and latent pathogens of woody Plants:diversity, ecology and impact [J]. Fungal Biological Reviews, 2007, 21: 90-106.

[20] 徐成楠, 遲福梅, 冀志蕊, 等. 藍(lán)莓葡萄座腔菌枝枯病研究進(jìn)展[J]. 中國果樹, 2014(5): 71-74.

[21] 朱琪麗, 趙會長, 謝甲濤, 等. 葡萄座腔菌侵染柑橘果實(shí)的報道[J]. 植物病理學(xué)報, 2017, 44(9): 1-6.

[22] 李文英, 李夏, 解開治, 等. 葡萄座腔菌科真菌的系統(tǒng)性和多樣性探討[J]. 生物多樣性, 2017, 25(8): 874-885.

[23] 程燕林. 中國部分真菌的系統(tǒng)發(fā)育及模式菌的遺傳多樣性研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2012.

[24] 馬翔, 遲文娟. 木棉干腐病病原鑒定及發(fā)病因素[J]. 中國森林病蟲, 2014, 33(6): 1-4.

[25] 王璠, 黃俊斌, 李國懷, 等. 葡萄座腔菌屬引起的果樹病害及研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù), 2013, 39(6): 7-13.

[26] 周如軍, 孫建潮, 薛彩云, 等. 花生褐斑病菌和網(wǎng)斑病菌混合侵染對侵染概率和潛育期的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(21): 4264-4271.

The Tea Brown Blight Disease Caused by Co-infection off.sp.and

ZHANG Yongle1, LIU Huixiang1*, XU Yongyu1, HE Bangling1*, ZHENG Jinzhu2

1. Shangdong Agricultural University/Shandong Research Center for Forestry Harmful Biological Control Engineering and Technology, Taian 27018, China; 2. Forestry Station of Culai Mountain, Tai′an 271027, China

s:A new leaf disease of tea plant was found in Donggang district of Rizhao, Shandong Province. The infected parts wereshrunken and malformed,turned brown, necrotic and named brown blight of tea. Two microorganisms were isolated from the edge of infected parts through tissue separation, and named as RC4and RC3.Their separation rates were 67.1% and 32.9% respectively. According to morphology, culture characteristics, multi- sequence analysis and Koch's Postulates test,f.spandwere found to be the cause of disease. This was the first report thatdamaged the leaves of tea plant.

tea plant,,., co-infection, identify

S435.711

A

1000-369X(2018)01-087-07

2017-09-03

2017-10-20

山東省茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-19-04）

張永樂，女，碩士，主要從事茶樹病害病原鑒定及綠色防控技術(shù)研究。*通訊作者：hxliu722@126.com，hebangling@126.com