王松琳，馬春雷，黃丹娟，馬建強(qiáng)，金基強(qiáng)，姚明哲*，陳亮*

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基于SSR標(biāo)記的白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

王松琳1,2，馬春雷1,2，黃丹娟1，馬建強(qiáng)1，金基強(qiáng)1，姚明哲1*，陳亮1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

利用62對SSR引物對16個白化、黃化茶樹品種資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，初步明確了不同白化、黃化品種的遺傳結(jié)構(gòu)，以及SSR標(biāo)記在白化、黃化品種鑒定上的適用性，為此類茶樹品種資源的鑒定評價提供了理論依據(jù)。經(jīng)過對引物篩選和擴(kuò)增條帶的分析，結(jié)果顯示：具有多態(tài)性的55對引物中，共檢測出169個等位基因，每對引物檢測出的等位基因數(shù)為2~5個，平均為3.07個；多態(tài)信息含量（PIC）和Shannon信息指數(shù)（I）的平均值分別是0.40和0.79；169個等位基因出現(xiàn)頻率在3.12%~96.88%之間；16個參試品種的遺傳距離在0.086~0.532，品種間遺傳結(jié)構(gòu)差異明顯；當(dāng)D≈0.18時，可將16個品種劃分為3類，其中大部分親緣關(guān)系相近或地理位置一致的品種聚為一類。此外，筆者根據(jù)不同引物的等位基因帶型構(gòu)建了16個白化和黃化茶樹品種的分子指紋圖譜，并篩選出3對核心引物（TM156、TM508、MSG0380）用于不同白化、黃化茶樹品種的鑒定。

白化；黃化茶樹；SSR標(biāo)記；指紋圖譜

白化、黃化茶樹是一類在特定條件下產(chǎn)生的具有不同程度葉綠素缺失的葉色突變體，屬于茶樹中的珍稀資源，目前在全國各地均有發(fā)現(xiàn)，如浙江的安吉白茶、景寧白茶、黃金芽，福建的白雞冠、金冠茶，江西的黃金菊等。已有研究表明，這類茶樹資源由于代謝機(jī)制的特異性，新梢芽葉的葉綠素合成減少，碳代謝受抑制，使其芽葉呈現(xiàn)出不同程度的白化或黃化現(xiàn)象，同時由于氮代謝增強(qiáng)，顯著提高了游離氨基酸的生成量，使得有些品種資源的游離氨基酸含量能達(dá)到6%以上，茶氨酸含量達(dá)3%以上[1-4]，以這類葉色突變體為原料制作的茶樣，因具有更高的氨基酸含量和更優(yōu)異的外形，使其經(jīng)濟(jì)價值更高，已成為各地茶農(nóng)增收的重要途徑[5-6]。但隨著新育成白化、黃化茶樹品種的增多，以及新品種較高的苗木及成品茶價格，很多不法商販開始利用茶葉和茶苗品種不易鑒定的特點(diǎn)，隨意對已有品種進(jìn)行更名銷售，導(dǎo)致市面上的此類茶樹品種魚龍混雜，“同物異名”和“同名異物”現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害了茶農(nóng)和消費(fèi)者的權(quán)益。因此，迫切需要建立一套快速、準(zhǔn)確的技術(shù)體系用于不同白化、黃化茶樹品種資源的鑒別，從而保證我國“白化和黃化茶”產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

基于形態(tài)特征的品種鑒定方法易受環(huán)境條件的影響，且要求鑒定者具有豐富的品種形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)驗(yàn)，同時在實(shí)際應(yīng)用中，往往因受到物候期的影響而無法及時準(zhǔn)確地鑒定大量品種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從DNA水平上對品種的遺傳特異性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境影響的鑒定已成為可能。作為當(dāng)今最先進(jìn)的指紋鑒定技術(shù)，分子指紋圖譜已發(fā)展出多種如RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、SSR（Simple sequence repeat）和SNP（Single nucleotide polymorphism）等標(biāo)記技術(shù)。其中SSR標(biāo)記以其多態(tài)性好、擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)量多、共顯性遺傳及操作簡單等特點(diǎn)，在構(gòu)建DNA指紋圖譜中應(yīng)用最為廣泛[7-9]。2007年SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記一起被國際植物新品種保護(hù)組織（Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）推薦為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法。目前這一方法已廣泛應(yīng)用于小麥[10-11]、玉米[12-13]、水稻[14-15]等多種農(nóng)作物的品種鑒定，同時在楊樹、櫻桃、銀杏等木本植物[16-18]中也有大量應(yīng)用。李莉等[19]利用36對SSR引物建立了大穗稻1126的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，可以有效解決雜交水稻親本1126的真?zhèn)涡约芭c其他品種的區(qū)分問題；王立新等[20]利用SSR標(biāo)記建立了蘋果栽培品種的DNA指紋圖譜庫，并進(jìn)行了品種鑒定。同時SSR分子標(biāo)記在茶樹遺傳多樣性和構(gòu)建指紋圖譜上的研究亦有大量的報道，如喬小燕等[21]利用105對核心EST-SSR標(biāo)記分析了廣西、廣東的105份茶樹資源，剖析遺傳結(jié)構(gòu)并據(jù)此繪制了遺傳結(jié)構(gòu)圖；黃丹娟等[22]從30對SSR引物中篩選出4對核心引物，構(gòu)建了39個PVP申請茶樹品種及近似品種的指紋圖譜，并為每個參試品種建立了24位數(shù)的圖譜二維碼。

本研究利用62對SSR引物對16種不同白化、黃化茶樹品種資源進(jìn)行分子鑒定，通過選取最少的核心引物組合，構(gòu)建SSR分子指紋圖譜；同時通過聚類分析初步揭示不同參試茶樹品種之間的遺傳結(jié)構(gòu)，以期為今后鑒定區(qū)別此類茶樹品種提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16種白化、黃化茶樹品種，均采自國家種質(zhì)杭州茶樹圃（表1）。采摘各供試樣品完整、無病蟲害感染的一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍后，于－80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取方法

將所有樣品在液氮中磨成粉末，采用改良的CTAB法[23]提取基因組DNA，利用ND-1000微量紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，后將DNA濃度稀釋至工作濃度20?ng·μL-1，用于PCR擴(kuò)增，剩余原液于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

從本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計、篩選的SSR引物中選取62對多態(tài)性高、擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物，用于供試材料的SSR-PCR分析。PCR反應(yīng)在ABI公司的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，采用10?μL的PCR反應(yīng)體系：ddH2O 6.2?μL、DNA 2?μL、Tap酶（2?U·μL-1）0.2?μL、dNTP（10?nmol·L-1）0.2?μL、10×PCR Buffer（Mg2+）1?μL，以及上下游Primer（10?μmol·L-1）各0.2?μL，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4?min；94℃變性30?s，不同溫度下退火30?s，72℃延伸30?s，共35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7?min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，150?V電壓下電泳80?min，銀染法顯色[24]，之后用凝膠成像儀拍照并記錄。

表1 供試茶樹品種的名稱及產(chǎn)地

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)處理采用人工讀帶的方法，將電泳圖上目的片段范圍內(nèi)清晰的條帶，按照分子量大小，從大到小按照A、B、C、D、E等依次記錄，缺失條帶以“XX”表示，記錄每個參試品種的基因型。利用軟件POPGENE[25]分析62對引物在16個參試品種中的擴(kuò)增等位基因數(shù)（Observed number of alleles, Na）、有效等位基因（Effective number of alleles, Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity, HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity, HE）、Shannon信息指數(shù)（Shannon′s information index, I）及等位基因出現(xiàn)頻率（Allele frequency）；利用軟件PowerMarker[26]計算基因型數(shù)（Genotype）和多態(tài)性信息量（Polymorphism information content, PIC），之后計算16個品種間的Nei′s遺傳距離[27]，并構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行聚類分析。最后從中挑選多態(tài)性含量高、擴(kuò)增條帶清晰的引物作為核心引物，根據(jù)其基因型轉(zhuǎn)化為0和1代碼，用于構(gòu)建16個參試品種的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 16個白化和黃化茶樹品種的SSR多態(tài)性

觀測62對引物的譜帶，發(fā)現(xiàn)除7對引物（TM347、TM368、TM414、TM568、TM577、TM585、TM614）之外，剩余的55對引物擴(kuò)增出的譜帶均表現(xiàn)出多態(tài)性。分析這55對引物的擴(kuò)增結(jié)果（表2），發(fā)現(xiàn)共擴(kuò)增出169個等位基因（Na），平均每對引物擴(kuò)增出3.07個，最多有5個，最少的只有2個；有效等位基因（Ne）的變異范圍在1.06~3.61之間，平均值為2.06；共檢測到基因型234個，范圍在2~9個之間；引物的觀測雜合度（HO）最大值為0.87（TM154），最小值為0（TM209）；期望雜合度（HE）最大值為0.75（TM508），最小值為0.12（TM512、TM590、TM598、TM609）；Shannon信息指數(shù)（I）的范圍在0.14~1.39之間，平均值為0.79；而多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍較大，在0.06~0.68之間，平均值為0.40，其中引物TM508的PIC值最高，而大于等于平均值的引物有31個，超過具有多態(tài)性引物總數(shù)的一半，這說明這些引物總體上多態(tài)性情況尚好，而多態(tài)性的高低往往與引物鑒別力有關(guān)，多態(tài)性越高，則鑒別力就越強(qiáng)[28]。

2.2 SSR標(biāo)記的各等位基因出現(xiàn)頻率

55對具多態(tài)性的引物共擴(kuò)增得到169個等位基因，其中TM584等位基因B的出現(xiàn)頻率最高，達(dá)到96.88%；而等位基因出現(xiàn)頻率最低為3.12%，分別為TM237的等位基因C、TM377的等位基因C、TM384的等位基因A等15個等位基因上（圖1）。由此可以看出16個參試茶樹品種各等位基因出現(xiàn)頻率差異很大。

表2 16個參試茶樹品種SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果

續(xù)表2

標(biāo)記等位基因有效等位基因基因型數(shù)觀測雜合度期望雜合度Shannon信息指數(shù)多態(tài)性信息含量 MarkerNaNeGenotypeHOHEIPIC TM467TM471TM476TM489TM494TM497TM505TM508TM512TM524TM526TM535TM536TM542TM561TM562TM566TM576TM584TM590TM596TM597TM598TM602TM609TM613TM620TM623MSG0380MSE0103MSE0107MSE0108MSE04503222333535322422432234232322533231.911.361.751.201.292.832.173.611.142.232.171.971.282.681.931.282.251.381.061.132.932.471.131.291.131.951.992.003.201.681.951.281.384332454936432633432265232433744340.130.190.250.190.130.250.630.750.130.530.560.500.250.500.560.130.130.310.060.130.680.540.130.250.130.440.670.470.750.440.600.130.250.490.270.440.180.230.670.560.750.120.570.540.510.230.650.500.230.570.280.060.120.660.620.120.230.120.500.510.520.710.420.500.230.280.830.430.620.310.451.070.861.390.281.080.860.690.381.140.680.381.040.530.140.231.091.040.230.450.230.810.690.691.280.730.770.380.540.430.230.340.160.210.570.450.680.120.510.450.370.200.570.370.200.510.260.060.110.580.520.110.210.110.410.370.380.630.370.400.200.26 Mean3.072.064.250.420.470.790.40

2.3 16個白化和黃化茶樹品種親緣關(guān)系分析

根據(jù)選取的55對SSR標(biāo)記的等位基因出現(xiàn)頻率，計算其Nei′s遺傳距離（D），結(jié)果發(fā)現(xiàn)16個茶樹品種的遺傳距離在0.086~0.532之間，其中黃金芽與黃葉寶之間的遺傳距離最大，四明雪芽和千年雪的遺傳距離則最小（表3）。

基于Nei′s遺傳距離，采用NJ法繪制16個品種的聚類圖（圖2）。從聚類圖中可以看出，當(dāng)D≈0.18時，16個品種基本聚為三大類，第Ⅰ類僅有2個品種，分別是來自江西的黃金菊和本課題組選育的株系花葉，它們屬于黃化茶樹資源，其黃化期較長，且春季新梢均表現(xiàn)出淺紫紅色；第Ⅱ類包括御金香、天臺白茶等10個品種，其中來自景寧的白茶品種景寧白茶1號和景寧白茶2號，以及來自浙江余姚的品種四明雪芽和千年雪都聚到了一起，但同樣來自余姚的御金香和黃金芽則與它們表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的遺傳距離，說明地理來源相同的品種可能會因?yàn)榫哂邢嗨频倪z傳背景聚集到一起，也可能因?yàn)橛H本來源不同而表現(xiàn)出較大的遺傳差異；第Ⅲ類則包括中黃2號、黃金芽、中黃1號和越鄉(xiāng)白茶4個品種，它們分別是從浙江縉云、余姚、天臺和嵊州當(dāng)?shù)厝后w種中發(fā)現(xiàn)的自然突變單株選育而來，聚類結(jié)果說明它們的遺傳基礎(chǔ)更相近。

注：A~E 表示不同等位基因。Note: A-E present different alleles.

2.4 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

分析篩選出的55對SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，參試的16個品種均具有特征譜帶（表4）。從表中可以看出，具有特征引物的16個品種中，每個品種都至少有1對引物可以獨(dú)立鑒別，最多的可達(dá)9對，利用特征引物可以對相應(yīng)品種完成快速鑒定，但沒有任何一對引物能夠?qū)⑦@16個白化、黃化茶樹品種全部區(qū)分開，這就需要通過引物相互組合的方式，利用2對或2對以上的引物進(jìn)行區(qū)分。

綜合考慮55對引物擴(kuò)增條帶清晰度、基因型數(shù)目及PIC值等因素，遵循以最少的引物鑒定全部品種的原則，篩選引物通過排列組合進(jìn)行區(qū)分。本研究選取TM156、TM508、MSG0380 3對引物（圖3），便可將參試的16個品種全部區(qū)分開，3對引物基因型數(shù)均≥6，PIC值≥0.54。之后3對引物按TM156、TM508、MSG0380的固定順序，將其等位基因型轉(zhuǎn)化0、1代碼串聯(lián)下來，作為16個茶樹品種的指紋圖譜，每個品種均得到1個14位數(shù)字的指紋圖譜編碼（表5）。

表3 16個參試茶樹品種之間的遺傳距離

注：JB1：景寧白茶1號，MP：MP1001，QNX：千年雪，YJX：御金香，HYB：黃葉寶，HY：花葉，AJHC：安吉黃茶，HJJ：黃金菊，AJBC：安吉白茶，TTBC：天臺白茶，SMXY：四明雪芽，JB2：景寧白茶2號，YXBC：越鄉(xiāng)白茶，ZH1：中黃1號，HJY：黃金芽，ZH2：中黃2號。

Note: JB2: Jingning Baich1, MP: MP1001, QNX: Qiannianxue, YJX: Yujinxiang, HYB: Huangyebao, HY: Huaye, AJHC: Anji Huangcha, HJJ: Huangjinju, AJBC: Anji Baicha, TTBC: Tiantai Baicha, SMXY: Siming Xueya, JB2: Jingning Baich2, YXBC: Yuexiang Baicha, ZH1: Zhonghuang1, HJY: Huangjinya, ZH2: Zhonghuang2.

圖2 16 個參試茶樹品種Neighbor-Joining 聚類圖

表4 16個參試茶樹品種的特征引物

圖3 3 對核心引物的擴(kuò)增條帶圖

表5 16個茶樹品種的分子指紋圖譜號碼

3 討論

3.1 不同白化品種的遺傳特性分析

茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與新品種的培育和推廣有著密不可分的關(guān)系，而茶樹種質(zhì)資源是培育優(yōu)質(zhì)茶樹品種的基礎(chǔ)，在茶樹育種研究中具有非常重要的地位。我國作為茶樹的原產(chǎn)地，茶樹種質(zhì)資源非常豐富，而其中紫化、黃化、白化等葉色變異資源因其較高含量的特征成分而備受關(guān)注。近十幾年在全國各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了十幾種白化、黃化茶樹資源，而浙江是目前白化茶樹種質(zhì)資源出現(xiàn)最為集中的區(qū)域，如目前推廣面積較大的白葉1號（原安吉白茶）、黃金芽及中黃系列等[29-33]。這些資源大多源自群體種中的自然突變，因?qū)ζ溥z傳背景不了解，導(dǎo)致很多資源無法作為骨干親本快速地用于白化茶樹品種的遺傳改良[34-36]。

因此，本實(shí)驗(yàn)室從2013年開始，對保存在國家種質(zhì)杭州茶樹圃的十幾份白化茶樹資源的遺傳特性進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)目前這些資源的白化表型均不屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，其中具有葉色遺傳特性的品種有7個，分別為黃金芽、白雞冠、安吉黃茶、中黃1號、中黃2號和安吉白茶，其中白雞冠的遺傳力最強(qiáng)，但因目前獲得的實(shí)生種子和成活植株數(shù)量都有限，其他還有未被發(fā)現(xiàn)的具有遺傳特性的黃化、白化資源也還有待進(jìn)一步觀察確定。

3.2 SSR引物的篩選

目前，構(gòu)建指紋圖譜往往遵循以盡可能少的引物區(qū)分全部參試品種這一原則，以求降低實(shí)驗(yàn)成本，減少繁重的實(shí)驗(yàn)工作，提高檢測效率[37]。引物的篩選是利用SSR標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜的重要組成部分，往往要求引物多態(tài)性PIC值高，穩(wěn)定性好。

本研究最初選用62對引物對參試品種進(jìn)行擴(kuò)增，通過擴(kuò)增譜帶進(jìn)行初步篩選，每個樣品均能獲得1~2條譜帶，其中55對引物的擴(kuò)增效果較為穩(wěn)定，均具有多態(tài)性，且平均多態(tài)信息含量為0.4，其中有21對引物多態(tài)信息含量較高（PIC＞0.5），多態(tài)性適中（0.2＜PIC＜0.5）的引物有26個，而多態(tài)性較差（PIC＜0.2）的僅有8個。多態(tài)信息含量是選取核心引物構(gòu)建指紋圖譜的參考條件，本研究所選用的55對SSR引物整體水平良好，符合構(gòu)建指紋圖譜進(jìn)而進(jìn)行品種鑒定的要求。

3.3 不同白化和黃化茶樹品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建

目前建立DNA指紋圖譜，主要采用的方法是核心引物組合法，這一方法并不需要進(jìn)行大量的引物篩選工作，只需通過核心引物組合的方式就能將多個親緣關(guān)系很近的品種區(qū)分開[38-40]，既保證鑒別的準(zhǔn)確度，又能提高鑒別效率，在其他作物研究中已有大量應(yīng)用。目前茶樹中利用核心引物組合法構(gòu)建指紋圖譜已有一定研究基礎(chǔ)，章志芳等[41]采用EST-SSR標(biāo)記對14個茶樹品種進(jìn)行遺傳多樣性分析和分子指紋鑒定，并從中選取4個核心標(biāo)記構(gòu)建各品種的指紋圖譜；郭燕等[42]從20對SSR標(biāo)記中篩選出4對核心標(biāo)記，構(gòu)建了40份貴州古茶樹資源的指紋圖譜，每份材料都獲得1個18位的分子指紋圖譜號碼。本研究從55對引物中篩選出了3對核心引物，構(gòu)建了16個白化茶樹品種的分子指紋圖譜，利用該圖譜可對目前市場上主栽的白化茶樹品種進(jìn)行鑒別，研究結(jié)果對今后白化新品種的選育和保護(hù)具有重要的意義。

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Analysis of Genetic Diversity and Construction of DNA Fingerprints of Chlorophyll-deficient Tea Cultivars by SSR Markers

WANG Songlin1,2, MA Chunlei1,2, HUANG Danjuan1, MA Jianqiang1, JIN Jiqiang1，YAO Mingzhe1*, CHEN Liang1*

1. Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100081, China

To differentiate and identify different albino tea cultivars, sixty two SSR primers were used to analyze the genetic diversity of 16 tea cultivars that exhibit the chlorina phenotype. The result showed that a total of 169 alleles were amplified by 55 SSR primers with good polymorphism, and the number of alleles per primer ranged from 2 to 5, with an average of 3.07. The average value of polymorphism information content (PIC) and Shannon’s information index (I) was 0.40 and 0.79 respectively, which indicate these albino and yellow-leaf tea cultivars having a moderate level of diversity. And the occurrence frequency of 169 alleles ranged from 3.12% to 96.88%. It suggested the difference of genetic structure among tested varieties is obvious. The Nei′s genetic distance (D) of sixteen tested cultivars ranged from 0.086 to 0.532. These cultivars could be divided into three categories when D was 0.18, and the cultivars with close relatives or similar geographical origin were clustered into one group. Lastly, three primers (TM156, TM508, MSG0380) with easy identification, good stability and high polymorphism, were finally chosen to establish the fingerprint. The 16 albino and yellow-leaf tea cultivars could be effectively distinguished by the primers. This study provided an important basis for the identification of albino tea cultivars, and the evaluation and utilization of these germplasm resources.

albino tea cultivars, SSR marker, fingerprinting

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-058-11

2017-07-07

2017-08-21

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）、國家自然科學(xué)基金（31100504、31500568）、浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2016C32024）、浙江省農(nóng)業(yè)（茶樹）新品種選育重大科技專項(xiàng)子課題（2016C02053-5）

王松琳，男，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種研究。*通訊作者