虞昕磊，艾于杰，曲鳳鳳，艾仄宜，劉淑媛，陳玉瓊，倪德江

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代謝組學(xué)在研究茶葉品質(zhì)形成中的應(yīng)用

虞昕磊，艾于杰，曲鳳鳳，艾仄宜，劉淑媛，陳玉瓊，倪德江*

園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 湖北 武漢 430070

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支，主要研究生物體系受內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后（基因的改變或環(huán)境的變化）產(chǎn)生的小分子代謝物的變化，目前已被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)和食品安全等研究領(lǐng)域。近年茶樹的代謝組研究也取得了突破性進(jìn)展。本文就植物代謝組學(xué)技術(shù)在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育、茶葉加工過(guò)程的品質(zhì)形成、茶葉功能性評(píng)價(jià)等方面研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。認(rèn)為代謝組學(xué)技術(shù)將在茶葉品質(zhì)形成及調(diào)控、茶樹基因功能注釋、茶樹良種選育、揭示代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理等研究方面發(fā)揮不可替代的作用。

茶樹；代謝組學(xué)；生長(zhǎng)發(fā)育；茶葉加工；茶葉功能

代謝組學(xué)（Metabolomics或Metabonomics）旨在研究生物體或組織甚至單個(gè)細(xì)胞中的糖類、脂類、氨基酸、核苷酸等全部小分子代謝物成分及其動(dòng)態(tài)變化[1]。20世紀(jì)90年代初Sauter等首次將代謝組分析引入植物系統(tǒng)診斷，最具代表性的是Fiehn等在擬南芥方面的研究工作[2]。根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同，將代謝組學(xué)分為代謝物靶標(biāo)分析（Target analysis）、代謝輪廓（譜）分析（Metabolite profiling）、代謝組學(xué)和代謝指紋分析（Metabolic fingerprinting）4個(gè)層次，其中代謝物靶標(biāo)分析為靶向分析方法，而其余3個(gè)層次均為非靶向分析方法。非靶向的代謝譜分析和代謝物靶標(biāo)分析是植物代謝組學(xué)近年研究的熱點(diǎn)[3-5]。本文簡(jiǎn)要介紹了植物代謝組學(xué)的研究方法，并著重從靶標(biāo)代謝物檢測(cè)和非靶標(biāo)代謝組分析的角度，綜述了代謝組學(xué)在研究茶葉品質(zhì)形成中的應(yīng)用。

1 植物代謝組學(xué)研究方法

植物代謝組分析流程（圖1）[6]：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣—樣品制備—代謝物分離及檢測(cè)—代謝物鑒定及注釋—數(shù)據(jù)分析及建模。

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和采樣

代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化：一是控制基本一致的植物生長(zhǎng)環(huán)境條件，如果不能達(dá)到每次實(shí)驗(yàn)在完全一致的條件下完成，也要保證同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)不同處理或材料的生長(zhǎng)環(huán)境條件一致[7]；二是設(shè)置實(shí)驗(yàn)重復(fù)，一般為4~6次，進(jìn)一步消除環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作的誤差，獲得具有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù)。采樣是最重要的步驟之一，是實(shí)驗(yàn)誤差的主要來(lái)源。為使采樣差異最小化，必須嚴(yán)格控制植物的生長(zhǎng)狀態(tài)、優(yōu)化采樣方法、采樣時(shí)間、采樣面積和數(shù)量等[8-9]。為準(zhǔn)確反映植株體內(nèi)的真實(shí)信息，

采樣時(shí)須立即阻斷內(nèi)在酶的活性，通常采用冰凍/液氮降溫法保存樣品。

1.2 樣品制備

樣品制備主要包括樣本冷凍干燥、液氮固定并于－80℃超低溫冰箱保存、代謝物浸提、分析前處理等步驟。冷凍干燥是去除樣本材料中水分子最常用的方法，代謝物浸提過(guò)程要求快速、高效、均一、穩(wěn)定，最普遍的方法是將植物組織器官用液氮快速冷凍，研磨成粉末后，迅速加入萃取溶劑。一般使用單一有機(jī)溶劑或混合溶劑浸提，對(duì)于極性代謝物，通常使用甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈或水以及不同比例的混合溶劑，而對(duì)于親脂性化合物，常用氯仿來(lái)萃取。

靶標(biāo)代謝物檢測(cè)和非靶標(biāo)代謝組分析是兩個(gè)不同的研究策略，樣品的制備方法也不同。在非靶標(biāo)代謝組研究中，楊亦揚(yáng)等[10]優(yōu)化出一種針對(duì)茶樹鮮葉浸提的快速前處理方法（70%乙醇，球磨機(jī)研磨5?min），且發(fā)現(xiàn)冷凍干燥法預(yù)處理鮮葉能更好地保持茶樹葉片中特征代謝產(chǎn)物。許國(guó)旺等[11]建立了基于GC-MS和LC-MS的紅茶、綠茶、烏龍茶的非靶標(biāo)代謝組分析方法，研究得出GC-MS提取物的優(yōu)化條件是體積分?jǐn)?shù)為45%的甲醇水性溶劑超聲浸提、N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）作為衍生化試劑效果最佳；LC-MS提取物的最優(yōu)條件為體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇水性溶劑加熱浸提。使用核磁共振（NMR）分析時(shí)，樣品的前處理方法將依賴某一類代謝物的提取方法進(jìn)行選擇，如氯仿提取、酸提取、甲醇提取、水提取等，Lee JE等[12]運(yùn)用1H-NMR技術(shù)對(duì)茶葉發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行非靶標(biāo)代謝譜監(jiān)測(cè)，樣品的浸提方法為去離子超純水提取。在靶標(biāo)代謝物檢測(cè)研究中，如利用GCMS檢測(cè)茶鮮葉中的游離態(tài)揮發(fā)性產(chǎn)物，萃取方法有頂空法（HSV）[13]、固相萃?。⊿PE）[14]、固相微萃取（SPME）[15]等。植物代謝物千差萬(wàn)別，其中很多物質(zhì)稍受干擾，結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變，目前還沒有適合所有代謝物的一次性提取方法，通常只能根據(jù)所要分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的溶劑成分、溶劑比例、浸提時(shí)間和浸提溫度等。

圖1 植物代謝組學(xué)工作流程圖

1.3 代謝物的分離和檢測(cè)

代謝物的分離和檢測(cè)是代謝組分析技術(shù)的兩個(gè)核心。分離技術(shù)主要采用氣相色譜（GC）、液相色譜（LC/HPLC/UPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）等色譜分離方法，而目前主要的檢測(cè)技術(shù)為質(zhì)譜（MS/3Q-MS/TOF-MS）和核磁共振波譜技術(shù)（NMR）。

氣相色譜（GC）本身分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，適用于分析容易氣化的低極性、低沸點(diǎn)代謝物，如各類揮發(fā)性化合物或衍生化后低沸點(diǎn)的物質(zhì)，如氨基酸[16]、有機(jī)酸、糖類、醇類等，能檢測(cè)到植物提取物中的部分初生代謝產(chǎn)物。茶葉香氣成分或揮發(fā)性物質(zhì)的分析常使用GC-MS、GC-TOF/MS等儀器，早期Wipawee P等[17]運(yùn)用PYGC-MS對(duì)日本的十幾種市售綠茶商品繪制了非靶標(biāo)代謝指紋圖譜，Christian S等[18]運(yùn)用GC-MS和GC-O（氣相色譜嗅聞技術(shù)）分析大吉嶺紅茶葉底和茶湯的香氣成分，Dong F等[19]運(yùn)用GC-MS研究了卷葉蛾啃噬引起的茶樹鮮葉內(nèi)源性揮發(fā)物的代謝變化，但單獨(dú)使用GC-MS還不能全面揭示植物所有代謝物的變化。

同GC相比，高效液相色譜（HPLC）/超高壓液相色譜（UPLC）相連接的質(zhì)譜類型較多，如四級(jí)桿質(zhì)譜、串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF/MS）等。LC-MS對(duì)樣品提取要求簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化，能檢測(cè)到植物中大部分的代謝物，尤其對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的檢出率相對(duì)較高。HPLC在茶葉品質(zhì)分析中的利用率較高，通常用于靶標(biāo)檢測(cè)茶葉中兒茶素和黃酮類[20]、茶黃素、咖啡堿、葉綠素、類胡蘿卜素[21]等代謝物，LC-MS也多用于檢測(cè)糖苷類香氣前體物質(zhì)[22]或萜烯類、花青素、原花青素等次代產(chǎn)物[23]。

核磁共振技術(shù)（NMR）是一種非侵入性分析技術(shù)，樣品前處理簡(jiǎn)單，可對(duì)粗提取液、細(xì)胞懸濁液、完整的組織中的代謝物進(jìn)行分析，測(cè)試手段豐富，特別是氫譜（1H-NMR）具有對(duì)含氫代謝產(chǎn)物的普適性，缺點(diǎn)是靈敏度低，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限。近年來(lái)NMR-MS技術(shù)結(jié)合液相色譜（LC）、固相萃?。⊿PE）用于植物代謝物結(jié)構(gòu)的鑒定中[24]，Justin等[25]將LC-LTQ-Orbitrap FTMS和LC-TOFMS- SPE-NMR 結(jié)合用于分析17種黑茶、綠茶、白茶的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)，經(jīng)鑒定得到177種酚類化合物，其中多數(shù)是3-黃烷醇和黃酮醇的糖基化或?；难苌?。

目前使用單一的分析手段尚不能實(shí)現(xiàn)某一植物所有代謝物的全景定性和定量分析，應(yīng)盡可能依靠多種分析手段，相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，跟蹤監(jiān)測(cè)植物代謝物的變化。

1.4 代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)

代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)是聯(lián)系代謝組學(xué)與其他系統(tǒng)生物學(xué)分支的橋梁。綜合性好且含有代謝途經(jīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)有京都基因與基因組百科全書（KEGG），KEGG提供植物代謝途徑（碳水化合物代謝、核苷代謝、氨基酸代謝及次生代謝等）查詢，并對(duì)催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注釋，且包含有氨基酸序列、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的鏈接等。MetaCyc屬于BioCyc子數(shù)據(jù)庫(kù)，是關(guān)于代謝途徑和酶的數(shù)據(jù)庫(kù)，闡述了超過(guò)1?600種生物體中的代謝途徑，包含了從大量的文獻(xiàn)和網(wǎng)上資源中得到的代謝途徑、反應(yīng)、酶和底物的資料。針對(duì)植物也建立了擬南芥、楊樹、水稻、高粱等12個(gè)物種的PlantCyc數(shù)據(jù)庫(kù)和查詢系統(tǒng)。除了大型的商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù)（如NIST、WILEY）之外，逐漸出現(xiàn)了課題組或研究中心建立的數(shù)據(jù)庫(kù)：格勒姆代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（GMD）包括代謝產(chǎn)物衍生后的GCMS和GC-TOFMS質(zhì)譜圖庫(kù)；METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)包含了人的23?000多種內(nèi)源性和外源性代謝物、小分子藥物及藥物代謝物、小肽等，含有各個(gè)化合物的LC-MS、MS/MS、FT-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可通過(guò)質(zhì)量、化學(xué)式和結(jié)構(gòu)等檢索；MMCD數(shù)據(jù)庫(kù)收集了超過(guò)2萬(wàn)個(gè)小分子代謝物的數(shù)據(jù)，配置有文本、化學(xué)結(jié)構(gòu)、核磁共振數(shù)據(jù)、質(zhì)譜學(xué)數(shù)據(jù)等搜索引擎；KNApSAcK數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)涵蓋大部分植物物種和代謝物關(guān)系的網(wǎng)站，包含了4萬(wàn)多種化合物和8?000多種植物物種的信息；MassBank是日本多所大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)共同建立的質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，主要收錄高分辨的質(zhì)譜，包含多種質(zhì)譜儀，如ESI-Q-TOFMS、GC-EI-TOF-MS、LC-ESI-TOF-MS等產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，參考譜圖含有多級(jí)質(zhì)譜的信息，已收集了超過(guò)12?000種初生代謝物和次生代謝物在正負(fù)離子模式下獲得的24?993多張質(zhì)譜圖；Yue Y等[26]在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上建立了茶樹代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（TMDB），為收集、檢索、標(biāo)準(zhǔn)化茶樹代謝物提供了堅(jiān)實(shí)的平臺(tái)，但仍有待完善。

1.5 代謝物的定性及其生物信息學(xué)注釋

代謝物的定性是植物代謝組研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?；瘜W(xué)分析報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)定性的程度將代謝物分為鑒定了的化合物、推斷性注釋的化合物、推斷性分類的化合物及未知化合物4類。GC-MS鑒定代謝物主要是通過(guò)軟件解卷積獲得純的質(zhì)譜峰，在已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，相似度較大說(shuō)明可能為該物質(zhì)，近年來(lái)采用保留指數(shù)（Kovats）輔助定性，對(duì)譜圖相似的同分異構(gòu)體有一定的區(qū)分作用，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)是最準(zhǔn)確的定性方法，例如GC-MS檢測(cè)茶鮮葉中的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)芳樟醇氧化物A/B/C/D屬于同分異構(gòu)體的4個(gè)物質(zhì)，反式結(jié)構(gòu)為呋喃型化合物，順式結(jié)構(gòu)為吡喃型化合物，還有丁香醛A/B/C等，可按ts（保留時(shí)間）出峰先后順序來(lái)區(qū)分鑒定[15]。而對(duì)于LC-MS，沒有標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，主要根據(jù)精確質(zhì)量和多級(jí)質(zhì)譜樹來(lái)鑒定。因此，利用高分辨率的質(zhì)譜儀器來(lái)確定化合物的分子量的方法至關(guān)重要。

全面注釋代謝物，解析代謝途徑是獲取代謝組生物學(xué)信息的關(guān)鍵。植物通過(guò)代謝途徑合成大量的化合物，在同一途徑上的代謝物相互關(guān)聯(lián)，可實(shí)現(xiàn)一種或多種生物學(xué)功能。目前只解析匯總了小部分代謝途徑。一方面可以通過(guò)KEGG或PlantCyc數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，將差異代謝物注釋到相關(guān)代謝途徑中，系統(tǒng)地揭示某類生物學(xué)功能的代謝基礎(chǔ)；另一方面，也可以根據(jù)代謝組數(shù)據(jù)與生物學(xué)功能的關(guān)聯(lián)，預(yù)測(cè)一些代謝途徑，加快植物代謝途徑的解析。Liu JW等[27]將UPLC-Q-TOF/MS和GC×GC-TOF/ MS結(jié)合，分析早/中/晚春的綠茶鮮葉代謝物種類和含量的變化，將其注釋到代謝途徑后，建立了代謝途徑與主要農(nóng)藝性狀的關(guān)系。生物的代謝是一個(gè)整體，各個(gè)代謝途徑相互關(guān)聯(lián)，構(gòu)成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)信息可以對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行注釋或重建，擬南芥[28]、玉米[29]、水稻[30]等物種的研究都取得了進(jìn)步。通過(guò)代謝途徑的相關(guān)性分析，也可以獲取代謝物之間的相關(guān)信息，Tai Y等[31]研究同屬山茶科山茶屬的茶樹（）和油茶（）的代謝差異及相關(guān)基因差異，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，建立一些相關(guān)的轉(zhuǎn)錄RNA和代謝物，發(fā)現(xiàn)一些緊密相關(guān)的代謝途徑。

1.6 代謝組數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)儀器分析得到的代謝組數(shù)據(jù)是一個(gè)龐大的多維矩陣，需將其降維轉(zhuǎn)化成適合多變量分析的數(shù)據(jù)形式，再采用一些統(tǒng)計(jì)分析方法，從中有效挖掘出所需信息。目前數(shù)據(jù)分析常用的主要手段為模式識(shí)別技術(shù)，分為非監(jiān)督（Unsupervised methods）和有監(jiān)督（Supervised methods）兩種。非監(jiān)督識(shí)別是根據(jù)數(shù)據(jù)本身的屬性來(lái)判斷樣本是否屬于不同類別的方法，如主成分分析（PCA）和系統(tǒng)聚類分析（HCA）。監(jiān)督識(shí)別是將已知類別的樣本隨機(jī)分為兩部分（訓(xùn)練集和測(cè)試集），利用已知類別的訓(xùn)練集建立模型，通過(guò)測(cè)試集的正確率來(lái)驗(yàn)證模型的可靠度，常見的方法有偏最小二乘法（PLS）和線性判別分析法（LDA）。

代謝組數(shù)據(jù)的分析流程主要為：原始數(shù)據(jù)—數(shù)據(jù)預(yù)處理（數(shù)據(jù)的歸一化、譜峰對(duì)齊、數(shù)據(jù)的標(biāo)度換算等）—多變量分析（PCA、PLS、PLS-DA、OPLS-DA）—模型驗(yàn)證—潛在的生物標(biāo)記物（群），最后通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索或查閱文獻(xiàn)，分析出差異標(biāo)志物所涉及的代謝途徑，并對(duì)其生物學(xué)意義進(jìn)行詳盡的解釋。軟件工具根據(jù)開發(fā)者和公開程度主要有分析儀器自帶的軟件包、公開的、可免費(fèi)下載的軟件包及網(wǎng)絡(luò)代謝組數(shù)據(jù)分析[32]3種，對(duì)現(xiàn)有的代謝組技術(shù)比較分析見表1。

2 茶樹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的代謝組學(xué)研究

茶樹起源于中國(guó)云貴高原，為多年生常綠葉用植物。茶樹鮮葉中干物質(zhì)占總量的25%左右，其化學(xué)成分由3.5%~7.0%的無(wú)機(jī)物和93.0%~96.5%的有機(jī)物組成。茶葉中經(jīng)分離鑒定的已知化合物有700多種，包括蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等初級(jí)代謝產(chǎn)物及多酚類、色素、茶氨酸、生物堿、芳香物質(zhì)、皂苷等次級(jí)代謝產(chǎn)物。鮮葉的品質(zhì)特征及性狀表現(xiàn)受多因素（品種、地理狀況、季節(jié)、栽培條件、栽培設(shè)施等）調(diào)控，僅對(duì)單個(gè)基因或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究無(wú)法闡明這些性狀的生理學(xué)或生物化學(xué)基礎(chǔ)，而利用代謝組學(xué)手段，研究不同茶樹品種的風(fēng)格特征及栽培育種過(guò)程中代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，能揭示茶樹品質(zhì)形成的代謝基礎(chǔ)，為茶樹遺傳改良提供新思路。

表1 代謝組學(xué)分離分析技術(shù)比較

2.1 生態(tài)環(huán)境對(duì)茶樹代謝的影響

近年來(lái)，基于GC-MS、LC-MS及NMR的茶樹非靶標(biāo)代謝組分析方法逐漸建立與改進(jìn)，并被應(yīng)用于茶樹種質(zhì)評(píng)價(jià)或品質(zhì)性狀相關(guān)的代謝組學(xué)研究中。

Lee JE等[33]建立了茶樹鮮葉樣本的1H-NMR非靶標(biāo)代謝譜分析方法，并繪制了某綠茶品種不同部位葉片的代謝指紋圖譜[34]，該方法可有效用于分析茶樹全代謝譜變化。Elis DP等[35]基于HPLC-DAD-ESI/MS研究巴西不同季度茶樹鮮葉的次生代謝產(chǎn)物變化，發(fā)現(xiàn)EGC和咖啡堿是區(qū)分巴西這兩個(gè)季度茶樹鮮葉代謝差異的標(biāo)志物。Liu JW等[27]將UPLC-Q-TOF/MS和GC×GC-TOF/MS相結(jié)合，分析了龍井43鮮葉在早/中/晚春的代謝變化，結(jié)果表明晚春季節(jié)，光照增強(qiáng)，溫度回升，芽葉的光合作用、光呼吸作用、三羧酸循環(huán)等代謝活動(dòng)增強(qiáng)，碳水化合物、黃酮及其糖苷類化合物含量增加，因而晚春綠茶的風(fēng)味品質(zhì)較高。同樣Dai WD等[36]選擇了尖波黃、寧州2號(hào)、正和大白茶等9個(gè)綠茶品種，運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS研究春/夏/秋三季的鮮葉代謝差異，數(shù)據(jù)分析得出不同季節(jié)的鮮葉代謝譜存在顯著差異，其中黃烷醇、聚酯型兒茶素、原花青素、槲皮素糖苷類、芹菜素糖苷類和氨基酸表現(xiàn)出明顯的季節(jié)波動(dòng)。Too C J等[37]分別在7~9月對(duì)肯尼亞的23個(gè)栽培種采樣，通過(guò)HPLC靶標(biāo)監(jiān)測(cè)鮮葉中茶氨酸的含量變化研究證實(shí)寒冷潮濕氣候（肯尼亞的7~9月）是茶樹獲得高含量茶氨酸的最佳季節(jié)，季節(jié)的變換導(dǎo)致氣候溫、濕度的差異，因而對(duì)鮮葉組織內(nèi)的氨基酸代謝影響較大。浙江的安吉白茶是一種早春敏感型的變異品種，早春氣溫較低時(shí)芽葉呈白色，隨著氣溫上升，葉色又由白漸轉(zhuǎn)為綠色。Li CF等[7]對(duì)安吉白茶白化階段與復(fù)綠階段的葉片分別采樣，采用GC-TOFMS非靶標(biāo)代謝譜分析找到了65種差異代謝物，其中主要差異代謝通路包括光合系統(tǒng)中的碳固定過(guò)程、苯丙氨酸合成代謝途徑，以及黃酮類生物合成途徑。Feng L等[38]又采用HPLC靶標(biāo)代謝物檢測(cè)的方法，選取4個(gè)白化品種（Ab、Hu、Th、Yu）和常規(guī)綠茶品種（Fd），分析了葉綠素a/b、類胡蘿卜素、兒茶素、咖啡堿、游離氨基酸等代謝組分，研究得出一定的環(huán)境條件，如低溫或異常的光照強(qiáng)度，白化茶品種的葉子變黃甚至呈白色，此時(shí)葉片的葉綠素、類胡蘿卜素、咖啡堿和總兒茶素含量明顯低于綠茶品種葉片，但游離氨基酸（包括茶氨酸）的含量上升，兒茶素和胡蘿卜素的代謝是構(gòu)成白化茶與常規(guī)綠茶品種間代謝差異的主要因素。

2.2 栽培條件對(duì)茶樹代謝的影響

茶樹主要以葉片為收獲對(duì)象，氮肥施用量往往較高。氮肥對(duì)茶葉碳氮代謝平衡影響明顯，能提高含氮物質(zhì)的含量，降低多酚類的含量。楊亦揚(yáng)等[39]將1H-NMR非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析與HPLC定量靶標(biāo)分析結(jié)合，研究了白天和夜晚不同施氮水平下茶樹新梢的代謝物差異，結(jié)果表明白天和夜晚所取茶樹新梢第二葉的代謝譜差異較大，主要差異標(biāo)志物是茶氨酸、葡萄糖和蔗糖，而施氮水平主要對(duì)游離氨基酸組分和兒茶素組分產(chǎn)生影響。茶樹雖然是一種富Al3+植物，但高濃度的鋁也會(huì)對(duì)茶樹產(chǎn)生脅迫，Xu Q S等[40]研究不同鋁離子濃度培養(yǎng)下的茶樹根系及葉片的代謝反應(yīng)，運(yùn)用GC-MS非靶標(biāo)代謝組分析得出，茶樹對(duì)Al3+的適應(yīng)能力與組織內(nèi)的氨基酸、糖、莽草酸的代謝有關(guān)。

在生產(chǎn)上，塑料薄膜大棚和遮陽(yáng)網(wǎng)是常用的栽培措施。冬季覆蓋塑料薄膜，可降低霜凍危害，縮短茶樹越冬休眠期，促進(jìn)茶樹早萌芽；夏季覆蓋遮陽(yáng)網(wǎng)可降溫增濕，改善光質(zhì)，降低茶樹體內(nèi)碳化物積累，提高夏茶品質(zhì)。國(guó)內(nèi)外對(duì)遮陽(yáng)覆膜的作用機(jī)理做了詳細(xì)研究，韓國(guó)Kang MK等[41]和Lee LS等[42]研究普通綠茶和碾茶的代謝組差異，發(fā)現(xiàn)碾茶中GC、芹菜素葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、蘋果酸等含量明顯高于普通綠茶，而EGC、EC、丁二酸、果糖含量下降，使碾茶的鮮味更強(qiáng)，收斂性減弱，遮蔭18~20?d能使茶葉中的氨基酸、咖啡堿、GC等物質(zhì)的含量顯著升高，EGC、ECG、槲皮素糖基化合物、山柰酚羰基化合物的含量降低，總的來(lái)說(shuō)遮蔭能提高綠茶的鮮味，但口感的豐富度偏弱。Zhang QF等[8]采用黑色遮陽(yáng)網(wǎng)和納米絕緣薄膜（遮蔭的同時(shí)，茶蓬面溫度下降2~4℃）對(duì)茶樹進(jìn)行覆蓋，研究光強(qiáng)和溫度對(duì)綠茶品質(zhì)的影響，結(jié)果遮蔭促進(jìn)茶樹黃酮類含量顯著降低，納米膜處理的黃酮醇含量下降，但黃酮糖苷類含量上升，經(jīng)KECG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到代謝途徑，發(fā)現(xiàn)苯丙烷/類黃酮代謝途徑的上下游反應(yīng)會(huì)因光強(qiáng)和溫度的外界環(huán)境作用而發(fā)生底物的競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。

非靶向的代謝譜分析方法無(wú)需對(duì)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從全局表征茶樹在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)（基因改變或環(huán)境變化）后其代謝產(chǎn)物的變化，若要進(jìn)一步了解茶葉中特定代謝物含量在不同環(huán)境、栽培、加工過(guò)程中的變化，則需代謝物靶標(biāo)檢測(cè)方法的輔助，詳見表2。

3 茶葉加工過(guò)程品質(zhì)形成的代謝組研究

3.1 加工過(guò)程中茶葉的代謝組研究

不同的茶類，因發(fā)酵程度和鮮葉在加工過(guò)程中的代謝變化的不同，風(fēng)味品質(zhì)各有特色。同時(shí)在制茶過(guò)程中，鮮葉含水量的變化速度和程度，都與制茶品質(zhì)有著密切的關(guān)系，把含水量75%的茶鮮葉制成含水量6%以下的干茶，是鮮葉大量失水的過(guò)程，隨著葉內(nèi)水分散失速度和程度的變化，引起葉內(nèi)一些成分發(fā)生相應(yīng)的一系列理化變化，從而逐步形成茶葉的色、香、味、形。

綠茶的殺青工藝有炒青和蒸青兩種，目的都是短時(shí)高溫條件下迅速滅活PPO、POD等氧化酶類，阻止鮮葉組織內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)，將內(nèi)含物最大化保留。Han Z X等[47]選取BAS和FUD兩個(gè)綠茶品種，分別按炒青和蒸青兩種工藝加工成干茶，采用HPLC靶標(biāo)檢測(cè)干茶的兒茶素和咖啡堿組分，HS-SPME/GC-MS分別檢測(cè)鮮葉和干茶樣本的揮發(fā)性代謝物，再結(jié)合感官審評(píng)分析得出，與炒青相比，蒸青處理降低了茶葉中兒茶素的比例和香葉醇、芳樟醇及其衍生物的含量，因此蒸青綠茶的澀味和收斂性以及花香都偏弱。Katsuno等[48]嘗試對(duì)新采摘的鮮葉先低溫貯藏（15℃，16?h，黑暗環(huán)境）一段時(shí)間，再加工成綠茶，研究表明GC-MS/GC-O-MS的揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)與感官審評(píng)結(jié)果一致，鮮葉經(jīng)低溫貯藏后加工的綠茶，花香、甜香更高，其中吲哚、茉莉內(nèi)酯、茉莉酮、香豆素、甲基茉莉酮酸酯等為關(guān)鍵差異代謝物，表明低溫貯藏期，減緩了鮮葉的失水速度，延長(zhǎng)了保鮮攤放時(shí)間，促進(jìn)了更多香氣前體物質(zhì)的合成與釋放。

紅茶的發(fā)酵工藝與茶湯的滋味、色澤、亮度、香氣密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)紅茶發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化及其作用機(jī)理廣泛關(guān)注，Youngmok K等[49]采摘同一茶樹品種的鮮葉，分別加工成綠茶（不發(fā)酵）、烏龍茶（20%發(fā)酵、40%發(fā)酵、60%發(fā)酵）、紅茶（80%發(fā)酵），對(duì)這5個(gè)干茶樣本分別分析，HPLC測(cè)兒茶素組分、LC-MS測(cè)酚類化合物代謝譜、福林酚法測(cè)多酚總量、酶標(biāo)儀法測(cè)PPO、POD等氧化酶活性、GC-MS測(cè)揮發(fā)性代謝物，大量的數(shù)據(jù)經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析后得出，5個(gè)干茶樣本的酚類和揮發(fā)性產(chǎn)物代謝譜存在顯著差異，酚類化合物的結(jié)構(gòu)、種類、含量以及氧化酶活性在發(fā)酵組樣本中也存在顯著差異，認(rèn)為發(fā)酵過(guò)程削弱了綠茶的抗氧化活性，減弱了黃酮類代謝物的潛在健康價(jià)值。Tan J F等[50]以鄂茶5號(hào)為原料，鮮葉、萎凋葉取樣，發(fā)酵葉（0、1、2、4、6、8、10、12、14?h）加工成干茶分別取樣，UPLC-3Q-TOFMS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，繪制了紅茶發(fā)酵過(guò)程的非揮發(fā)性物質(zhì)代謝譜。

Zhang L等[51]研究比較了云南省14種生普洱和14種熟普洱的代謝指紋差異，采用HPLC靶標(biāo)代謝物分析方法，檢測(cè)兒茶素、氨基酸、咖啡堿等組分，發(fā)現(xiàn)在熟普中檢測(cè)到24個(gè)物質(zhì)特征峰，生普中檢測(cè)到21個(gè)特征峰，熟普和生普的品質(zhì)組分相似，個(gè)別獨(dú)有的特征峰極有可能是發(fā)酵過(guò)程的變化導(dǎo)致。

表2 基于茶樹鮮葉樣本的代謝組研究

3.2 次級(jí)代謝物與茶葉滋味和香氣的關(guān)系

茶樹能制造并積累種類繁多的有機(jī)物，包括大量的多酚類、生物堿、茶氨酸，以及色素、皂苷、芳香物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物是構(gòu)成茶葉風(fēng)味特質(zhì)的重要元素。再者，茶葉又是重要的飲料和醫(yī)藥原料，因此，茶樹次級(jí)代謝的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

茶樹的次級(jí)代謝與茶葉香氣關(guān)系密切，精確表征茶葉香氣化學(xué)成分有重要的科研價(jià)值。Zhu Y等[52]通過(guò)GC×GC-TOFMS對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)綠茶“西湖龍井”的香氣物質(zhì)進(jìn)行了分析，從55個(gè)西湖龍井茶樣本中鑒定得到478種揮發(fā)性化合物，其中37種化合物與龍井茶的香氣呈正相關(guān)，65種化合物對(duì)香氣品質(zhì)有負(fù)作用，確定了西湖龍井共同的香氣物質(zhì)。Yang T等[15]采用HS-SPME/GC-MS定性和定量市售的15種茶產(chǎn)品和14種茶樹鮮葉中的芳樟醇化合物，結(jié)果顯示芳樟醇在不同茶類及不同茶樹品種間差異顯著。萜類化合物具有較低的氣味閾值和較愉悅的香氣，對(duì)茶葉香氣的影響較大。Zhu Y等[53]選取茅山白茶、英德1號(hào)紅茶、鐵觀音烏龍茶、白牡丹白茶、普洱黑茶5大茶類的代表，采用HS-SPME/GC-MS檢測(cè)干茶樣本中的萜烯類揮發(fā)性化合物，分析得出S-檸檬烯、S-芳樟醇、(2S,5S)-芳樟醇氧化物A、(2S,5R)-芳樟醇氧化物B、R-4-松油醇、(2S,5R)-芳樟醇氧化物C、(2S,5S)-芳樟醇氧化物D、S-松油醇、R-紫羅蘭酮、對(duì)茶螺烷A和對(duì)茶螺烷B是主要的萜類成分。糖苷揮發(fā)物（GBVS）對(duì)烏龍茶的特異香氣有著突出貢獻(xiàn)，Cui J L等[54]分別選取福鼎大白茶制作紅茶，鐵觀音制作烏龍茶，從鮮葉、萎凋葉/曬青葉、發(fā)酵葉/攤青葉、干茶分別取樣，采用LC-MS研究紅茶和烏龍茶加工過(guò)程中的糖苷揮發(fā)物（GBVS）的代謝變化，分析得出紅茶的揉捻階段，茶葉中的主要糖苷類物質(zhì)——茜黃櫻草糖苷含量急劇下降，而吡喃葡萄糖苷含量變化不大；烏龍茶的萎凋階段，GBVS的總量逐漸升高，在230℃的固定干燥階段GBVs的總量急劇上升，其中β-吡喃葡萄糖苷所占比重最大，并對(duì)照KEGG對(duì)GBVs及其衍生物的代謝通路作了分析，詳見表3。

植物體內(nèi)的生化反應(yīng)多數(shù)由一些小分子代謝物的糖基化反應(yīng)調(diào)控，茶樹組織內(nèi)的糖基化合物多數(shù)未被鑒定，Dai WD等[56]采用UPLC-QTOF/MS非靶標(biāo)代謝組分析方法，結(jié)合HMDB、TMDB等數(shù)據(jù)庫(kù)，以及參考已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道，選取了14種茶樹品種，鮮葉中61種糖基化合物被檢出鑒定，另外40種新型糖化物待推測(cè)鑒定中。中國(guó)的紫鵑茶因葉片富含花青素呈紫色而聞名，Lv HP等[46]將HPLC靶標(biāo)代謝物分析法與LC-MS非靶標(biāo)代謝組分析方法結(jié)合，采摘紫鵑茶鮮葉，并分別加工成炒青綠茶、蒸青綠茶、曬青綠茶、烏龍茶、紅茶，分別檢測(cè)鮮葉和干茶樣本中的花青苷化合物，該研究結(jié)果為研究紫娟花青苷的代謝通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了理論依據(jù)。

4 代謝組學(xué)在茶學(xué)研究中存在的問(wèn)題及思考

目前代謝組學(xué)技術(shù)在茶學(xué)研究中仍存在一些問(wèn)題需要改進(jìn)。

首先，代謝組學(xué)研究要求數(shù)據(jù)豐富、重復(fù)性好，如何降低分離分析工具的偏差和局限性，如何標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、采樣處理?xiàng)l件一致，如何優(yōu)化出簡(jiǎn)單易行、浸提效率高的樣品前處理方法是獲得較好的代謝組數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟。為了控制和監(jiān)測(cè)樣品提取、樣品前處理及儀器分析過(guò)程中的誤差，一是要設(shè)置空白對(duì)照：空白對(duì)照不含待分析的樣品，它可以檢測(cè)有機(jī)溶劑的純度、衍生化試劑雜峰、塑料管及槍頭吸管中的增塑劑等外來(lái)污染物；二是要設(shè)置質(zhì)控樣本：質(zhì)控樣本可以是不同類型標(biāo)準(zhǔn)品的混合物，也可以從所有待測(cè)樣本中取出很小一部分混合作為質(zhì)控樣本；第三設(shè)置內(nèi)標(biāo)：在代謝物浸提溶劑中加入已知量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以檢測(cè)提取和分析過(guò)程中存在的誤差；四是保留時(shí)間指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加：一般是正構(gòu)烷烴或飽和脂肪酸甲酯的同系物，用來(lái)計(jì)算保留指數(shù)，對(duì)代謝物進(jìn)行定性，而且還可以校正保留時(shí)間的漂移。

其次，茶樹有別于其他作物，次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜，雖然隨著代謝組分析儀器水平和技術(shù)的普及和要求提高，已經(jīng)能夠大眾化地做不少工作，但仍有相當(dāng)多的化合物不能被準(zhǔn)確鑒定和分析，不少發(fā)表的代謝組分析的文章存在化合物鑒定不清、含糊、測(cè)定不準(zhǔn)的問(wèn)題。例如采用GC-TOFMS非靶標(biāo)分析茶鮮葉代謝組，檢測(cè)不到香氣有關(guān)的重要次生代謝產(chǎn)物，而有機(jī)溶劑萃取/GC-MS法檢測(cè)鮮葉的香氣成分效果顯著，說(shuō)明某一類型代謝物的檢測(cè)，除了分辨率高的分析儀器，有針對(duì)性的浸提分離方法也是關(guān)鍵。無(wú)論是采用NMR和MS哪一種分離分析手段，對(duì)于物質(zhì)的定性分析，仍需依靠與METLIN、NIST、HMDB、Moto DB、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并需要參考大量的文獻(xiàn)報(bào)道，且應(yīng)盡可能多地準(zhǔn)備代謝物標(biāo)準(zhǔn)品去定性定量。

表3 基于干茶樣本的代謝組研究

第三，如何將代謝組與其他組學(xué)技術(shù)更好地結(jié)合，發(fā)揮更大作用，仍有待實(shí)踐。例如，Tai YL等[31]研究同屬山茶科山茶屬的茶樹（）和油茶（）的代謝差異及相關(guān)基因差異，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，建立一些相關(guān)的轉(zhuǎn)錄RNA和代謝物，發(fā)現(xiàn)一些緊密相關(guān)的代謝途徑。其他植物的研究，如代謝組學(xué)結(jié)合致敏反應(yīng)和毒理反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，可以綜合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物的安全性，分析轉(zhuǎn)基因植物、非轉(zhuǎn)基因植物和其他栽培品種的代謝譜，以主成分分析和聚類分析來(lái)區(qū)分這些相似的代謝譜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物代謝譜的變異范圍存在于各栽培品種之間?？购?、抗寒、抗病蟲一直是茶樹育種關(guān)心的問(wèn)題，當(dāng)植物處于脅迫、病害時(shí)，代謝物在免疫應(yīng)答反應(yīng)中扮演重要角色，結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以闡述免疫應(yīng)答反應(yīng)中植物細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝譜的變化。

隨著代謝組技術(shù)的不斷更新優(yōu)化，研發(fā)出分辨率更高的分析設(shè)備及數(shù)據(jù)挖掘和分析工具，整合多種分離分析手段，建立更完備的數(shù)據(jù)庫(kù)，植物代謝組學(xué)將在茶葉研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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Metabolomics Application in the Study of Tea Quality Formation

YU Xinlei, AI Yujie, QU Fengfeng, AI Zeyi, LIU Shuyuan, CHEN Yuqiong, NI Dejiang*

College of Horticulture &Forestry Sciences, HuaZhong Agricultural University; Key Laboratory of Horticulture Plant Biology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China

Metabolomics, an important branch of systems biology, mainly study the changes of small molecule metabolites affected by the internal and external environments (gene or environmental changes). Metabolomics has been widely applied in the field of natural medicine development, botany, microbiology and food safety researches. The application of metabolomics in tea science has also been developed rapidly in recent years. In this article, the application of metabolomics in three major aspects of tea researches (growth and development, the quality formation during processing and the evaluation of tea function) was reviewed and discussed. We believed that metabolomics would play an irreplaceable role in the analysis of gene function, the regulation of metabolic network, the cultivation and the quality improvement in tea.

, metabolomics, growth and development, tea processing, tea functions

S571.1；Q51

A

1000-369X(2018)01-020-13

2017-04-05

2017-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（34114057）

虞昕磊，女，博士研究生，主要從事茶樹代謝與分子生物學(xué)研究，jiayoualei@sina.com。*通訊作者：nidj@mail.hzau.edu.cn