李曉東，吳鋼，劉永軍，施立新

（上海市華山北院寶山分院 1. 普通外科 3. 檢驗(yàn)科，上海 200431；2. 上海市華山醫(yī)院 普通外科，上海 200040）

微小RNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用[1-4]，現(xiàn)已知miR-192是抑癌基因，轉(zhuǎn)染miR-192基因后結(jié)腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降[5]，但miR-192在結(jié)腸癌的臨床研究方面仍較少報(bào)道[6]。miR-23a是一種促癌基因，在結(jié)腸癌、胃癌等消化道腫瘤呈高表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[7-8]，而miR-23a對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行系統(tǒng)的臨床研究較少。本組研究通過檢測結(jié)腸癌患者血清miR-192和miR-23a水平，觀察其在結(jié)腸癌患者發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年1月—2015年12月在我院就診手術(shù)的結(jié)腸癌患者115例，術(shù)前均未行放療和化療，均病理確診為結(jié)腸癌。同時(shí)選擇在我院行手術(shù)治療的腺瘤性息肉的患者45例和在我院行結(jié)腸鏡檢查的健康體檢者20例。均排除合并其他部位腫瘤，免疫和血液系統(tǒng)疾病，均知情同意，均在醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。115例結(jié)腸癌患者中，男50例，女65例；年齡35～70歲，平均年齡（56.94±10.64）歲；大體分型：隆起型23例，浸潤型51例和潰瘍型41例；浸潤深度：侵及漿膜層85例，未及漿膜層30例；腫瘤分化程度：中高分化66例、低分化49例；Dukes分期：A期24例、B期49例、C期31例、D期11例。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本的抽取 患者入院時(shí)和手術(shù)2周后空腹取肘靜脈血，將標(biāo)本分別裝入干燥試管中。干燥試管中的血液標(biāo)本予以室溫下靜置1 h，以3 000r/min的速度，離心5 min，離心半徑9 cm，將血清保存在-70 ℃的冰箱中保存待檢測。

1.2.2 real time PCR檢 測 血 清miR-192和miR-23a 取各組空腹血5 mL放置在真空干燥管中，用2 000r/min的離心速度離心10 min，取血清1 mL加入1 mL TRIzol，混勻后，在4 ℃以1 200r/min離心10 min，取上清液加入0.2 mL的氯仿，靜置3 min，在4 ℃以1 200r/min離心15 min，取上清液，加入0.5 mL異丙醇，在-70 ℃靜置過夜。第2天，溶解后，4 ℃以1 200r/min離心10 min，去除上清液，用DEPC水配制的75%的乙醇洗1遍，略晾干，加入20 μL DEPC處理過的雙蒸水溶解。紫外分光度計(jì)測總RNA含量，測定A260及A280值，在1.8～2.1用于檢測。各組RNA抽提產(chǎn)物分別取1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體添加量。將樣品徹底混合均勻，短暫離心，37 ℃孵育60 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存。根據(jù)目標(biāo)基因的imRNA序列，按照引物設(shè)計(jì)的原則，用設(shè)計(jì)軟件primer express 3.0設(shè)計(jì)并合成qPCR檢測引物及探針，miR-192上游引物：5'-GGG GCT GAC CTA TGA ATT GA-3'和下游引物5'-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3'；miR-23a的上游引物：5'-GGG GAT CAC ATT GCC AGG-3'和下游引物5'-AGT GCG TGT CGT GGA GTC-3'；U6的上游引物：5'-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3'和下游引物5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3'。目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針均為5'端采用FAM報(bào)告熒光標(biāo)記，3'端采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記。取2 μg中RNA加入內(nèi)參U6和目的小分子RNA miR-192和miR-23a逆轉(zhuǎn)錄引物，在70 ℃反應(yīng)10 min，后取出立即冰育2 min，隨后加入其他試劑。其反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃反應(yīng)10 min。立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻-80 ℃以備后用。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為：在95 ℃反應(yīng)3 min，起到起始模板變性；在95 ℃反應(yīng)15 s，PCR循環(huán)中模板變性，然后60 ℃中反應(yīng)45 s起到退火的作用，循環(huán)35次。采用相對(duì)定量的方法對(duì)miRNA進(jìn)行相對(duì)量表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，以2-△△CT表示目的基因相對(duì)于配對(duì)正常標(biāo)本的變化倍數(shù)，其中△CT=CTimRNA-CTU6，△△ CT=△ CTimRNA-△CT對(duì)照組。

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察結(jié)腸癌、結(jié)腸良性息肉和健康對(duì)照組的miR-192和miR-23a表達(dá)水平變化，并觀察結(jié)腸癌患者血清miR-192和miR-23a表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，手術(shù)后其水平的變化及其相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組正態(tài)分布資料采用方差分析，各組之間的比較采用q檢驗(yàn)，獨(dú)立因素的兩組比較采用t檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。兩個(gè)變量連續(xù)正態(tài)數(shù)據(jù)采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清miR-192和miR-23a水平

健康對(duì)照組血清miR-192的相對(duì)量為3.15±1.06，腺瘤性息肉組為1.39±0.68，結(jié)腸癌組為0.78±0.25，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=283.714，P＜0.05），結(jié)腸癌患者血清miR-192水平明顯低于良性息肉組和健康對(duì)照組（均P＜0.05）；健康對(duì)照組血清miR-23a的相對(duì)量為0.98±0.24，良性息肉組為1.28±0.65，結(jié)腸癌組為3.48±1.06，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187.250，P＜0.05），結(jié)腸癌患者血清miR-23a水平明顯高于良性息肉組和健康對(duì)照組（均P＜0.01）。

手術(shù)后結(jié)腸癌患者血清miR-192相對(duì)量為2.48±0.96，較手術(shù)前明顯升高（t=18.377，P＜0.05）；而術(shù)后結(jié)腸癌患者miR-23a的相對(duì)量為1.16±0.76，較術(shù)前明顯降低（t=19.075，P＜0.05）（圖1）。

2.2 結(jié)腸癌患者血清miR-192和miR-23a水平與臨床病理因素的關(guān)系

結(jié)腸癌患者術(shù)前血清miR-192和miR-23a水平與年齡，性別，腫瘤直徑，大體分型，浸潤深度，脈管浸潤，神經(jīng)浸潤和CEA水平無關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、Dukes分期具有關(guān)（均P＜0.05）（表1）（圖2）。

2.3 結(jié)腸癌患者血清miR-192和miR-23a的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-192水平與miR-23a水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.747，P＜0.05）（圖3）。

圖1 結(jié)腸癌患者手術(shù)前后RT-PCR檢測情況 A：融解曲線；B：術(shù)前擴(kuò)增曲線；C：術(shù)后擴(kuò)增曲線

表1 血清miR-192和miR-23a水平與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系

表1 血清miR-192和miR-23a水平與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系（續(xù)）

圖2 結(jié)腸癌不同腫瘤分化程度，淋巴轉(zhuǎn)移和Dukes分期的箱線圖

圖3 結(jié)腸癌患者血清miR-192水平與miR-23a水平的相關(guān)性

3 討 論

miR-192基因?yàn)槿梭w的11號(hào)染色體，主要在肝臟，腎臟和結(jié)腸等組織中表達(dá)，在結(jié)腸癌，肝癌和肺癌等惡性腫瘤中miR-192表達(dá)水平明顯降低，被認(rèn)為是腫瘤抑制性miRNA[9-11]。有研究[12]表明miR-192可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)行為，其差異性表達(dá)可以作為臨床惡性腫瘤的早期診斷，分期，轉(zhuǎn)移和預(yù)后等重要指標(biāo)，miR-192可以靶向性抑制二氫葉酸還原酶，從而控制細(xì)胞周期；同時(shí)研究已經(jīng)證實(shí)多種G1和G2周期檢查的關(guān)鍵蛋白的編碼基因是miR-192的靶基因，機(jī)體可以通過上調(diào)miR-192基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期G1和G2期阻滯。在基因芯片研究顯示miR-192有62個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，其中8個(gè)基因參與細(xì)胞周期，被證實(shí)為miR-192的直接靶點(diǎn)[13]。本組研究表明結(jié)腸癌患者血清的miR-192水平明顯低于結(jié)腸息肉和健康體檢者，手術(shù)后結(jié)腸癌患者血清miR-192水平出現(xiàn)明顯升高，說明機(jī)體下調(diào)miR-192水平與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有明顯的關(guān)系，去除結(jié)腸癌原發(fā)病后，機(jī)體的微環(huán)境得到改善，從而機(jī)體的miR-192水平出現(xiàn)明顯的升高。本組研究還表明結(jié)腸癌患者血清miR-192水平與結(jié)腸癌分期、分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明基因miR-192表達(dá)與結(jié)腸癌患者的轉(zhuǎn)移，分化程度和惡性程度均有一定的聯(lián)系，可能參與了結(jié)腸癌的進(jìn)展過程。

miR-23a是miR-23的一種亞型，近期的研究[14]表明miR-23a參與了細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，包括增殖、凋亡和變異等。其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有顯著的聯(lián)系，一般扮演著致癌基因的角色，在結(jié)直腸癌，前列腺癌等腫瘤表達(dá)明顯上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15-16]。有研究[17-18]表明miR-23a直接通靶向性抑制轉(zhuǎn)移抑制因子1蛋白，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。并有研究[19-20]表明miR-23a表達(dá)的上調(diào)與結(jié)腸癌分期的升高，浸潤深度增加和腸道黏膜惡性轉(zhuǎn)化具有明顯的相關(guān)性，miR-23a可以通過促進(jìn)細(xì)胞上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移浸潤的重要生物學(xué)指標(biāo)。本組研究表明血清miR-23a水平在結(jié)腸癌患者明顯強(qiáng)于結(jié)腸息肉和健康體檢者，并且手術(shù)后結(jié)腸癌患者血清的miR-23a水平明顯降低，說明miR-23a表達(dá)增加與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有明顯的相關(guān)性，去除癌癥的微環(huán)境機(jī)體的miR-23a表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低。本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清miR-23a水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明miR-23a基因調(diào)控可能與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的聯(lián)系。本組研究還表明結(jié)腸癌的miR-192水平與miR-23a水平呈負(fù)相關(guān)，miR-192在此研究中為抑癌基因，而miR-23a為促癌基因，兩者的聯(lián)系是否直接聯(lián)系或者通過其他基因發(fā)生聯(lián)系上不清楚，需要在將來進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果提示，血清miR-192和miR-23a水平的變化在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用，兩者有望作為結(jié)腸癌的重要腫瘤標(biāo)記物。

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