王平軍，曾其毅

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣州 510282)

膿毒癥是感染導致的全身性炎癥反應，可導致膿毒癥急性腎損傷[1～3]。膿毒癥急性腎損傷病情嚴重，病死率為40%～60%[4]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞膜的組成成分，常作為外來毒素建立膿毒癥急性腎損傷模型[5]。研究表明，細胞凋亡與炎癥反應共同導致了膿毒癥急性腎損傷[1,6,7]。miRNA是一種內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過降解mRNA或抑制mRNA翻譯，在轉錄后水平負性調節(jié)基因表達[8～10]。miR-21是一種抗凋亡因子，其抗凋亡作用或參與膿毒癥急性腎損傷[1～6]。但miR-21與LPS誘導的人腎皮質近曲小管上皮細胞炎癥反應的關系鮮見報道。2017年3月～2018年2月，本研究觀察了LPS誘導人腎皮質近曲小管上皮細胞炎癥反應后miR-21的表達變化，旨在探討miR-21在膿毒癥急性腎損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞，中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫；PBS、MEM培養(yǎng)基、NEAA，廣州一科生物科技有限公司；FBS、青-鏈霉素雙抗、DMSO，美國Gibco公司；LPS，美國Sigma公司。TRIzol RNAiso,日本TaKaRa公司；mRNA及miRNA逆轉錄試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；定量PCR試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司；IL-6一抗，沈陽萬類生物科技有限公司；GAPDH一抗，美國Bioworld公司；Lipofectamine3000美國Life Technologies公司；兔IgG二抗，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理 將細胞接種于含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗、1% NEAA的MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合80%～90%時傳代，傳代次日更換新的培養(yǎng)基，之后每2～3天更換培養(yǎng)基1次。對照組和LPS組：對照組以等量PBS處理，LPS組以終濃度10 μg/mL LPS誘導4、8、12 h。轉染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h組或NC mimics (50 nmol) 24 h組(即轉染陰性對照物組)：轉染miR-21 mimics或NC mimics的HK-2細胞，先采用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。轉染miR-21 mimics (50 nmol)24 h+LPS處理組和轉染陰性對照處理1組：轉染miR-21 mimics或NC mimics (50 nmol) 24 h后再給予10 μg/mL LPS誘導8 h。轉染miR-21 mimics(100 nmol)24 h +LPS處理組和轉染陰性對照處理2組：轉染miR-21 mimics或NC mimics 24 h后再給予10 μg/mL的LPS誘導12或24 h。

1.3 IL-6 mRNA及miR-21表達檢測 采用RT-qPCR法?？俁NA提取：TRIzol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。逆轉錄及擴增引物：采用逆轉錄試劑盒和特異性miRNA莖環(huán)引物進行miR-21的逆轉錄，實時熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量。逆轉錄反應條件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。將逆轉錄獲得的cDNA加入40 μL DEPC水稀釋5倍，- 20 ℃保存。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s共40～50個循環(huán)。IL-6逆轉錄反應條件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。將逆轉錄獲得的cDNA加入40 μL DEPC水稀釋5倍，- 20 ℃保存。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性15 s、60 ℃退火 15 s、72 ℃延伸30 s共40～50個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。將對照細胞目的基因相對表達量設為1，計算其他各組目的基因相對表達量。

1.4 IL-6蛋白表達檢測 采用Western blotting法。培養(yǎng)的細胞貼壁后，吸棄完全培養(yǎng)基，加入1 mL冷的PBS沖洗2次，每次振搖數(shù)次，盡量去除培養(yǎng)基；在每毫升預冷的Lysis Buffer中加入10 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL PMSF，混勻。每培養(yǎng)皿或6孔板所需的Lysis Buffer體積為50～100 μL，然后按樣品個數(shù)計算所需的Lysis Buffer總體積，冰上保存待用。在每培養(yǎng)皿或6孔板加入等體積的Lysis Buffer，然后用刷子刮下培養(yǎng)皿或6孔板中的貼壁細胞，轉移至1.5 mL EP管中。將所有樣品置于4 ℃搖床平臺，劇烈振蕩30 s，冰上放置4 min，重復5次。4 ℃ 12 000 g離心5 min，上清即為提取的細胞總蛋白，- 80 ℃保存。采用Bradford法進行蛋白定量。將96孔板置于振蕩器上震蕩20 s，排除氣泡，放置2 min，酶標儀于595 nm波長處檢測各孔的吸光度值，以蛋白含量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。蛋白樣品1 μL+去離子水4 μL(即為5倍稀釋)，加入考馬斯亮藍G250溶液195 μL，震蕩混勻，放置2 min，酶標儀于595 nm波長處檢測各孔的吸光度值，根據(jù)標準曲線得到相應的蛋白含量。蛋白變性及分裝保存：5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液loading buffer 要先振蕩離心，吸液時槍頭垂直液面緩慢吸出，避免觸及管壁。按每4 μL蛋白樣品中加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，振蕩混勻，管口覆蓋封口膜，沸水加熱5 min，使蛋白充分變性。蛋白條帶獲取：先配膠，然后電泳(上樣量為60 μg)，再轉膜(將蛋白轉至PVDF 膜)，BSA封閉1.5 h，洗膜3次，一抗封閉過夜，次日洗膜3次后二抗避光封閉1 h，避光洗膜3次，最后用Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)獲得圖片。用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。將對照細胞目的蛋白相對表達量設為1，計算其他各組目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 LPS對HK-2細胞IL-6 mRNA及蛋白表達的影響 LPS組LPS誘導4、8、12 h IL-6 mRNA相對表達量分別為12.82±0.34、3.01±0.49、2.61±0.51，均較對照組明顯升高(P均<0.05)。在4 h時IL-6升高達到峰值，隨后迅速下降。LPS組LPS誘導4、8、12 h IL-6蛋白相對表達量分別為3.13±0.33、2.79±0.51、2.69±0.21，均較對照組明顯升高(P均<0.05)。

2.2 LPS對HK-2細胞miR-21表達的影響 LPS組LPS誘導4、8、12 h miR-21相對表達量分別為0.71±0.07、0.73±0.03、0.68±0.08，均較對照組明顯下降(P均<0.05)。

2.3 過表達miR-21對LPS誘導HK-2細胞IL-6 mRNA表達的影響 轉染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h組miR-21相對表達量為17.07±1.40，較轉染陰性對照物組表達明顯升高(P<0.01)，說明轉染成功。轉染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h+LPS處理組IL-6 mRNA相對表達量為0.68±0.07，較轉染陰性對照處理1組明顯降低(P<0.05)。

2.4 過表達miR-21對LPS誘導HK-2細胞IL-6蛋白表達的影響 轉染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS處理組LPS誘導12 h miR-21相對表達量為6.85±1.77，較轉染陰性對照處理2組表達明顯升高(P<0.05)，說明轉染成功。轉染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS處理組LPS誘導24 h IL-6蛋白相對表達量為0.52±0.15，較轉染陰性對照處理2組表達明顯降低(P<0.01)。

3 討論

在HK-2細胞膿毒癥急性腎損傷細胞模型中，以往文獻一般以0、4、8、12 h作為時間點，以0、1、5、10 μg/mL作為LPS的誘導濃度，最后選用5 μg/mL LPS誘導8 h來建立模型[5,11]。本實驗選擇10 μg/mL作為LPS誘導濃度，誘導時間分別為0、4、8、12 h。本研究結果顯示，在LPS誘導HK-2細胞4、8、12 h后，與對照組比較(等量PBS處理12 h)，IL-6 mRNA和蛋白相對表達量均明顯升高，與以往文獻[5]報道一致，表明本實驗建立的膿毒癥急性腎損傷細胞模型是成功的。越來越多研究表明，miRNA在膿毒癥或膿毒癥急性腎損傷中具有重要作用，如miR-21[1,3,6,10]、miR-375[2]、miR-210[12]、miR-107[13]、miR-23b[14]、miR-146a[15,16]、miR-132[17]。以往研究證實，膿毒癥時miR-21表達上升[18]，急性腎損傷時miR-21表達亦上升[19]。然而，在膿毒癥急性腎損傷時miR-21表達變化鮮見報道。本研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-21在膿毒癥急性腎損傷HK-2細胞中的表達明顯下降，表明miR-21可能參與膿毒癥急性腎損傷中的炎癥反應過程。

miRNA幾乎參與每個細胞過程，可調節(jié)人類大約1/3的基因[6]，是腫瘤與炎癥反應中重要的調節(jié)者[2]。miR-21被發(fā)現(xiàn)在所有腫瘤中表達上升[20,21]，可作為腫瘤的生物學標志物[22～24]。另外一些研究則關注miR-21在腫瘤中的作用[25,26]。miR-21在許多疾病發(fā)生、發(fā)展過程中是一種強力的抗凋亡因子。在膿毒癥急性腎損傷研究中，miR-21的抗凋亡作用亦參與其中[1,6]。有研究顯示，miRNA與膿毒癥的調節(jié)相關，具有抗炎或促炎作用。在膿毒癥或其他炎癥反應中，促炎的miRNA有miR-155[27,28]、miR-375[2]，抗炎的miRNA有miR-21[10,29～31]、miR-210[11]、miR-146a[15]。以往研究證實，miR-21與炎癥反應有關[29,30,32]，但鮮有研究關注miR-21與膿毒癥急性腎損傷的關系[10]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21能夠降低LPS誘導的HK-2細胞IL-6 mRNA和蛋白表達。表明miR-21在膿毒癥急性腎損傷中可能具有抗炎作用，與以往研究[10,29,30]基本一致。

總之，IL-6在LPS誘導的HK-2細胞中表達升高、miR-21表達降低。過表達miR-21能夠降低LPS誘導的HK-2細胞IL-6 mRNA和蛋白表達，證實miR-21在膿毒癥急性腎損傷中可能具有抗炎作用，有可能作為膿毒癥急性腎損傷治療的新靶點。