沙凱輝，劉同剛，張曉麗

(1 濱州醫(yī)學(xué)院，山東濱州 256600；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

尿路感染是一種常見(jiàn)反復(fù)發(fā)作的感染性疾病。尿路致病性大腸桿菌(UPEC)是健康成年人尿路感染的主要侵入性病原體[1～3]。細(xì)胞骨架微絲的主要成分為球狀肌動(dòng)蛋白，在多種因素作用下可聚合成纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-Actin)[4～6]。這一肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)改變可引起細(xì)胞骨架重排，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞質(zhì)膜擴(kuò)展、形變等，以便于UPEC等病原菌侵襲膀胱上皮細(xì)胞。整合素是由α和β亞基組成的異源二聚體，是一種重要的跨膜受體，可調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用。原花青素是一種復(fù)雜的黃酮類(lèi)天然聚合物。已有研究證實(shí)，原花青素具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤的生物學(xué)活性[7～12]。2017年7月～2018年3月，本研究探討原花青素對(duì)UPEC黏附、侵襲膀胱上皮細(xì)胞的影響及其機(jī)制，旨在為防治尿路感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱上皮細(xì)胞株T24(ATCC HTB-4)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，-150 ℃冰箱保存。UPEC J96(血清型O4：K6，ATCC 700336)購(gòu)自ATCC，- 70 ℃冰箱保存。自冰箱內(nèi)取出細(xì)菌，室溫下緩慢溶解；取50 μL菌液接種于5 mL LB肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；用接菌環(huán)將細(xì)菌接種于TSA固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜形成單菌落，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，保存期約1周。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 自冰箱內(nèi)取出T24細(xì)胞，37 ℃溫水中快速溶解，轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基的離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清，更換新的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將T24細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2.5×105個(gè)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和原花青素組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。陰性對(duì)照組和原花青素組分別加入等量DMSO和亞抑菌濃度的原花青素孵育40 min。

1.3 UPEC對(duì)T24細(xì)胞黏附能力的影響 采用平板菌落計(jì)數(shù)法。用細(xì)菌接種環(huán)從LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落并接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖床振蕩過(guò)夜；取50 μL菌液加入5 mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)搖床培養(yǎng)3 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；3 000 r/min離心3 min，棄去上清，收集細(xì)菌，加入一定量PBS重懸；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)625 nm波長(zhǎng)處的光密度值為0.6時(shí)，細(xì)菌濃度為1×109CFU/mL；用無(wú)血清無(wú)雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基按照100∶1的感染復(fù)數(shù)重懸細(xì)菌，振蕩混勻，備用；將各組細(xì)胞用3倍體積的預(yù)溫?zé)o菌PBS清洗，隨后將重懸后的菌液接種于24孔板內(nèi)，置于37 ℃孵箱中孵育，使細(xì)菌感染細(xì)胞；孵育2 h，以3倍體積的預(yù)溫PBS清洗孔板，洗去未黏附細(xì)菌；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打，收集至無(wú)菌EP管，每孔加入無(wú)菌PBS 800 μL清洗，同樣收集至EP管，漩渦振蕩混勻；以10倍稀釋法梯度稀釋10 000倍后，吸取100 μL細(xì)胞裂解液涂布于LB瓊脂平板上。37 ℃恒溫孵箱倒置培養(yǎng)，次日菌落計(jì)數(shù)。以空白對(duì)照組的黏附率為100%，計(jì)算陰性對(duì)照組和原花青素組相對(duì)黏附率。

1.4 UPEC對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響 感染2 h，每孔加入500 μL含100 μg/mL慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h以殺死胞外菌；以3倍體積的預(yù)溫PBS清洗孔板，充分洗去慶大霉素；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打，收集至無(wú)菌EP管，每孔加入無(wú)菌PBS 800 μL清洗，同樣收集至EP管，漩渦振蕩混勻；以10倍稀釋法梯度稀釋100倍后，吸取100 μL細(xì)胞裂解液涂布于LB瓊脂平板上。37 ℃恒溫孵箱倒置培養(yǎng)，次日菌落計(jì)數(shù)。以空白對(duì)照組的侵襲率為100%，計(jì)算陰性對(duì)照組和原花青素組相對(duì)侵襲率。

1.5 T24細(xì)胞表面整合素受體α3、β1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。提取總RNA：按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞總RNA，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?。RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：使用real-time PCR儀，參照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)說(shuō)明書(shū)將各反應(yīng)試劑混勻后加入PCR管，短暫離心后置于PCR儀，設(shè)置好反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。Integrin α3正向引物：5′-AAGGGACCTTCAGGTGCA-3′，反向引物：5′-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3′；Integrin β1正向引物：5′-GAAGGGTTGCCCTCCAGA-3′，反向引物：5′-GCTTGAGCTTCTCTGCTGTT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 T24細(xì)胞F-Actin表達(dá)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。以預(yù)冷的PBS(1 mL/孔)清洗細(xì)胞3次；0.25%胰酶消化2 min；預(yù)冷的含10%血清培養(yǎng)基終止消化，收集至EP管，1 000～3 000 r/min離心3 min，棄上清；預(yù)冷的PBS清洗1次，離心棄上清；加入4%多聚甲醛500 μL混勻，室溫靜置15 min；PBS稀釋離心棄上清，預(yù)冷的PBS清洗1次；加入0.1%曲拉通500 μL混勻，室溫靜置10～20 min；PBS稀釋離心棄上清，預(yù)冷的PBS清洗1次；加入5 μg/mL羅丹明-鬼筆環(huán)肽160～180 μL振蕩混勻，室溫避光1 h；PBS稀釋離心棄上清，預(yù)冷PBS清洗2次；400 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞F-Actin的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組黏附率、侵襲率比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、原花青素組相對(duì)黏附率分別為(100.00±0.00)%、(109.05±2.21)%、(82.91±3.35)%，相對(duì)侵襲率分別為(100.00±0.00)%、(111.43±8.70)%、(77.14±6.56)%。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，原花青素組相對(duì)黏附率、相對(duì)侵襲率均明顯降低(P均<0.01)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較P均>0.05。

2.2 各組T24細(xì)胞表面整合素受體α3、β1 mRNA表達(dá)比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、原花青素組T24細(xì)胞表面整合素受體α3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.09、0.91±0.10、0.42±1.07，T24細(xì)胞表面整合素受體β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.41±0.12、3.55±0.23、1.07±0.26。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，原花青素組T24細(xì)胞表面整合素受體α3、β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較P均>0.05。

2.3 各組F-Actin相對(duì)熒光強(qiáng)度比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、原花青素組未經(jīng)UPEC J96感染細(xì)胞的F-Actin相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為24.95±1.06、25.40±0.72、22.43±0.87，經(jīng)UPEC J96感染細(xì)胞的F-Actin相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為30.13±2.97、32.40±3.56、24.33±1.00。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，原花青素組無(wú)論是UPEC J96未感染細(xì)胞還是UPEC J96感染細(xì)胞，F(xiàn)-Actin相對(duì)熒光強(qiáng)度均明顯降低(P均<0.01)，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較P均>0.05。

3 討論

尿路感染是一種常見(jiàn)的感染性疾病，每年全世界有1.5億人發(fā)生尿路感染，1 400萬(wàn)人因尿路感染而入院，估計(jì)每年用于衛(wèi)生保健的總成本約60億美元[2,13～15]。UPEC主要導(dǎo)致急性膀胱感染(膀胱炎)和腎感染(腎盂腎炎)，并可引起嚴(yán)重慢性腎功能衰竭或菌/敗血癥。尿道黏膜是病原微生物定植最為棘手的部位之一，黏附和侵襲是UPEC等尿路致病菌逃避宿主免疫反應(yīng)和抗生素治療最重要的策略，可促進(jìn)病原體更有效地定植于尿道并引發(fā)感染[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，原花青素預(yù)處理膀胱上皮T24細(xì)胞后，UPEC J96對(duì)膀胱上皮細(xì)胞的黏附和侵襲能力均明顯降低。

在最為常見(jiàn)的膀胱感染中，最關(guān)鍵的一步即是UPEC等尿路致病菌利用其表達(dá)的Ⅰ型菌毛黏附素FimH與膀胱上皮細(xì)胞膜表面含有甘露糖殘基的蛋白受體uroplakin Ⅰa及整合素α3/β1等結(jié)合[1,17]，進(jìn)而激活多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，介導(dǎo)UPEC等病原菌侵襲進(jìn)入膀胱上皮細(xì)胞。整合素是由α和β亞基組成的異源二聚體，是一種重要的跨膜受體，可調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用[18～20]。UPEC UTI89可直接或間接通過(guò)基質(zhì)蛋白與α3/β1整合素受體結(jié)合，進(jìn)而侵襲宿主細(xì)胞[19]。本研究結(jié)果顯示，原花青素可明顯降低T24細(xì)胞整合素α3/β1表達(dá)，提示原花青素可能通過(guò)調(diào)節(jié)α3/β1整合素受體表達(dá)，繼而減少UPEC黏附，從而通過(guò)下游信號(hào)通路抑制肌動(dòng)蛋白聚合和UPEC侵襲。

真核細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成，其中微絲主要發(fā)揮支撐、非肌性運(yùn)動(dòng)和信息傳導(dǎo)作用，微管則主要用于維持細(xì)胞形態(tài)及輔助細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[21]。眾所周知，UPEC可改變宿主的信號(hào)級(jí)聯(lián)活化并使宿主微絲肌動(dòng)蛋白聚合重排，這是UPEC侵襲宿主細(xì)胞所必需的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，原花青素預(yù)處理T24細(xì)胞，可明顯抑制骨架微絲肌動(dòng)蛋白聚合，進(jìn)而減少UPEC侵襲。因此，原花青素所致的UPEC侵襲減少可能依賴(lài)于Actin多聚態(tài)F-Actin表達(dá)降低。

綜上所述，原花青素可通過(guò)抑制膀胱上皮細(xì)胞表面整合素受體表達(dá)，從而減少UPEC對(duì)膀胱上皮細(xì)胞黏附；通過(guò)抑制F-Actin表達(dá)，抑制UPEC侵襲膀胱上皮細(xì)胞。