李娜，熊嬌，史明媚，王露露，付立仙

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000)

血管形成是惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是改善腫瘤預(yù)后的重要突破口[1]。組織因子途徑抑制物2(TFPI-2)，又名胎盤蛋白-5，是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物，廣泛存在于人體組織和器官。TFPI-2能夠抑制多種蛋白酶活性，如基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶等[2]，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，如血管生成、腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等。有研究證實(shí)，TFPI-2能夠阻礙新生血管的形成，從而抑制人纖維肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。但是TFPI-2在宮頸癌組織中的表達(dá)變化及其對(duì)宮頸癌血管新生的影響尚不清楚。微血管密度(MVD)是組織血管新生狀況的直接反映。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是經(jīng)典的促血管生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞血管內(nèi)皮增生，促進(jìn)血管生成，并增加血管通透性[4]。本研究觀察了宮頸癌組織TFPI-2表達(dá)變化，并分析宮頸癌組織TFPI-2表達(dá)與VEGF表達(dá)及MVD的相關(guān)性，探討TFPI-2對(duì)宮頸癌組織血管新生的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2014年12月收治的80例宮頸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為宮頸癌、具有完整的病例資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并其他惡性腫瘤、全身感染性疾病、肝腎疾病等?；颊吣挲g33～62歲，其中≤50歲37例、>50歲43例。有HPV感染者45例、無HPV感染者35例；病理分級(jí)G1者32例，G2者31例，G3者17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；按照2009年NCCN指南臨床分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ+Ⅱ期65例、ⅢⅢ+Ⅳ期15例。另收集50例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者的病灶組織標(biāo)本為CIN組，患者年齡30～65歲；20例接受宮頸活檢者病理結(jié)果為正常宮頸的受檢者的宮頸組織標(biāo)本為對(duì)照組，年齡32～63歲。三組入組者年齡相比P>0.05。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意，入組者已簽署知情同意書。

1.2 各組標(biāo)本TFPI-2、VEGF檢測(cè) 采用免疫組化SP法。各組標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片。二甲苯脫蠟，100%、95%、85%乙醇浸泡水化，98 ℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH=6.0)中浸泡15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清室溫封閉15 min，棄血清，滴加TFPI-2、VEGF一抗工作液，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌5 min ,洗滌3次，，滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌5 min ，洗滌3次， DAB顯色，充分沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以已知陽性切片為陽性對(duì)照，PBS替代一抗為陰性對(duì)照。陽性染色結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒。每份標(biāo)本均選擇10個(gè)含有陽性細(xì)胞的高倍視野(×200)分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞百分率≤25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞百分率26%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞百分率>50%計(jì)算3分。按染色程度計(jì)分：無陽性著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，深黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分。兩項(xiàng)得分之和>3分判定為陽性，≤3分定為陰性。

1.3 各組標(biāo)本MVD檢測(cè) 采用免疫組化SP法行CD34染色，具體方法同1.2。結(jié)果判定采用Weidner量化分析法[5]：低光鏡下尋找微血管分布均勻區(qū)域(排除腫瘤出血區(qū)和邊緣反應(yīng)區(qū))。隨機(jī)選取5個(gè)視野，高倍鏡(×200)下計(jì)數(shù)染成棕黃色的血管數(shù)，計(jì)算平均值，即為MVD。與鄰近腫瘤細(xì)胞、血管、結(jié)締組織界限清晰，且呈棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，即為1個(gè)微血管數(shù)；排除腫瘤硬化區(qū)以及、>8個(gè)紅細(xì)胞的血管。采用Decaussin法[6]，以MVD平均值為分界線，≥平均值者判定為高M(jìn)VD，否則判定為低MVD。

2 結(jié)果

2.1 三組標(biāo)本TFPI-2、VEGF蛋白表達(dá)及MVD比較 宮頸癌組、CIN組、對(duì)照組TFPI-2陽性表達(dá)率分別為21.25%(17/80)、52.00%(26/50)和85.00%(17/20)，宮頸癌組TFPI-2陽性表達(dá)率與CIN組、對(duì)照組相比，P均<0.05；CIN組TFPI-2陽性表達(dá)率與對(duì)照組相比，P均<0.05。宮頸癌組、CIN組、對(duì)照組VEGF陽性表達(dá)率分別為72.50%(58/80)、42.00%(21/50)和10.00%(2/50)，宮頸癌組VEGF陽性表達(dá)率與CIN組、對(duì)照組相比，P均<0.05；CIN組VEGF陽性表達(dá)率與對(duì)照組相比，P均<0.05。

宮頸癌組、CIN組、對(duì)照組MVD分別為(22±8)、(10±2)、(6±2)條/HP，宮頸癌組MVD與CIN組、對(duì)照組相比，P均<0.05；CIN組MVD與對(duì)照組相比，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組標(biāo)本TFPI-2表達(dá)與VEGF表達(dá)、MVD的相關(guān)性 宮頸癌組標(biāo)本中TFPI-2、VEGF均為陽性8例，TFPI-2陽性VEGF陰性5例，TFPI-2陰性VEGF陽性5例，TFPI-2、VEGF均為陰性1例，Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組標(biāo)本TFPI-2和VEGF蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.632,P<0.05)。以MVD平均值為分界線判定MVD高低，宮頸癌組標(biāo)本高M(jìn)VD者53例、低MVD者37例。宮頸癌組標(biāo)本高M(jìn)VD且TFPI-2陽性6例，高M(jìn)VD且TFPI-2陰性47例，低MVD且TFPI-2陽性13例，低MVD且TFPI-2陰性24例。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組標(biāo)本TFPI-2蛋白表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.685,P<0.05)。

3 討論

在我國，宮頸癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位。全世界每年大約有53萬宮頸癌新發(fā)病例和27萬死亡病例，且大約85%死亡病例發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家或者發(fā)展中國家[7]。目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，將為臨床治療宮頸癌提供新的治療思路和理論依據(jù)，并為宮頸癌防治藥物的研發(fā)提供新機(jī)制、新靶點(diǎn)、新方向。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被降解是腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的關(guān)鍵步驟，TFPI-2能夠下調(diào)與ECM相關(guān)的蛋白酶的酶活性，維持ECM的穩(wěn)定性，從而減慢或者阻礙腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程[8]。大量研究結(jié)果表明，TFPI-2在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)，如胰腺癌[9]等。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織TFPI-2蛋白陽性表達(dá)率顯著低于宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織和正常宮頸組織，提示TFPI-2抑制了宮頸癌的發(fā)生，具有抑癌基因的功能，與Libra等[10]的研究結(jié)論一致。TFPI-2表達(dá)降低是宮頸癌相關(guān)的分子標(biāo)志之一。惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等均依賴于腫瘤血管生成[11]，同時(shí)血管生成也是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。目前，評(píng)估腫瘤血管生成狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)是MVD[12]，MVD可直觀地反映腫瘤的血管生成能力。同時(shí)MVD能夠反映腫瘤的侵襲性及惡性程度，可以作為多種腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立指標(biāo)[13]。

VEGF能夠增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，是促進(jìn)血管生成的最主要的因子[14]。VEGF的表達(dá)水平，也可以作為評(píng)價(jià)血管活性強(qiáng)度的良好指標(biāo)之一。VEGF不僅與腫瘤血管生成有關(guān)，而且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[15,16]。本研究結(jié)果顯示宮頸癌組織TFPI-2蛋白表達(dá)和VEGF表達(dá)、MVD均呈負(fù)相關(guān)。表明TFPI-2能夠抑制宮頸癌組織血管形成。而VEGF可能是其中重要的效應(yīng)蛋白。TFPI-2可能是通過抑制宮頸癌組織VEGF表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌組織血管生成。

TFPI-2通過下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)抑制了宮頸癌新生血管的生成，阻斷其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤增殖，進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。這為宮頸癌的臨床治療提供了新的研究方向。

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