胡煥煥，姬國(guó)杰，陳陽(yáng)，常朋蘭，劉艷青，張寧，王冰，薛釗，劉瑞，周紅偉，石曉衛(wèi)

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

大豆苷元(4,7-二羥基異黃酮)，又稱大豆黃酮、大豆素，主要存在于豆科、鳶尾科植物中，為植物雌激素的一種，類似雌激素樣化合物的非甾體植物化學(xué)物質(zhì)。大豆苷元屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、防止血管增生、抗炎癥、抑制癌細(xì)胞增殖、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等多種生物學(xué)功能，廣泛用于治療婦女更年期綜合征、前列腺癌、乳腺癌、心臟病、心血管病、骨質(zhì)疏松等疾病[1,2]。大豆苷元化學(xué)結(jié)構(gòu)中的糖苷以游離的形式存在[3]，與17-β-雌二醇的結(jié)構(gòu)和功能相似性，并且可以結(jié)合雌激素受體α(ERα)和β(ERβ)[4～6]，進(jìn)而劑量依賴性的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[7]。但是其中的中間環(huán)節(jié)仍不明確。VEGF是血管生成因子中最主要的一種，下調(diào)VEGF可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。VEGF-C是VEGF中功能最強(qiáng)的一種。本研究觀察了大豆苷元對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Hela中VEGF-C mRNA表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑儀器 宮頸癌Hela細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO)，大豆苷元(Sigma，美國(guó))；Trizol細(xì)胞裂解液(Invitrogen，美國(guó))。電子分析天平(ME204，梅特勒)、落地冷凍高速離心機(jī)(Thermo/Multifuge X1R，美國(guó))、梯度PCR儀(Sensoquestlabcycler standard，德國(guó)senso)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、電泳儀(Power Pac Universal，Bio-Rad)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及大豆苷元應(yīng)用方法 宮頸癌Hela細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每天換液一次，2～3 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。稱取大豆苷元用DMSO溶液溶解，0.22 μm孔徑的除菌過(guò)濾膜過(guò)濾，4 ℃低溫避光保存，兩周內(nèi)使用。設(shè)觀察1、2、3組和對(duì)照組。觀察1、2、3組分別加入大豆苷元至終濃度為10、40、80 μmol/l。對(duì)照組不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 各組細(xì)胞VEGF-C mRNA檢測(cè) 采用半定量RT-PCR法。Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照行半定量RT-PCR：VEGF-C上游引物 5′-CAGTTACGGTCTGTGTCCAGT-3′，下游引物5′-GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度300 bp；GAPDH上游引物5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物5′-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度662 bp。反應(yīng)體系20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 72 ℃ 10 min。電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照并測(cè)算各條帶灰度。VEGF-C相對(duì)表達(dá)量以VEGF-C條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

觀察1、2、3組及對(duì)照組細(xì)胞VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.533±0.011、0.184±0.006、0.164±0.007、0.613±0.011。觀察1、2、3組細(xì)胞VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察3組低于觀察1、2組(P均<0.05)，觀察2組低于觀察1組(P<0.05)。

3 討論

腫瘤在生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中受到多種因素的影響，其中血管生成占有重要的地位，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有重要意義。VEGF-C即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，與VEGFC-A、胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E合稱VEGF家族六大成員。有研究表明，該基因與其受體在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、咽喉癌等惡性癌癥中表達(dá)的含量明顯高于正常細(xì)胞[8]。因此，該基因可以被用來(lái)研究宮頸癌的遺傳與表達(dá)情況。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在某些未知因素下，瘤細(xì)胞代償性產(chǎn)生VEGF-C，通過(guò)旁分泌上調(diào)淋巴內(nèi)表皮細(xì)胞內(nèi)的VEGF-C受體mRNA，刺激受體表達(dá)，與其特異結(jié)合相互作用，啟動(dòng)酪氨酸激酶信號(hào)系統(tǒng)，引起淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生[9]。綜上所述，VEGF-C的表達(dá)與惡性腫瘤間的機(jī)制可能是：①VEGF-C可能激活其受體VEGF受體-3，導(dǎo)致原發(fā)腫瘤的增生從而有利于癌細(xì)胞向淋巴管擴(kuò)散；②VEGF-C與其受體VEGF受體-2結(jié)合后，可介導(dǎo)淋巴管通透性增加；③VEGF-C的過(guò)表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞侵襲性。因此，可以通過(guò)阻斷以上途徑降低腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移率[10]。體外研究表明，大豆苷元可以通過(guò)抑制酪氨酸蛋白激酶、絲裂原活化激酶或DNA異構(gòu)酶Ⅱ等來(lái)抑制細(xì)胞增殖并引發(fā)凋亡。VEGF-C是多種血管生成因子中最主要的，它可以特異性的作用于淋巴管生長(zhǎng)因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。VEGF-C在良、惡性宮頸病變的陽(yáng)性表達(dá)率有顯著差別[11]。我們認(rèn)為，VEGF下調(diào)的表達(dá)可以抑制宮頸癌的生長(zhǎng)，Braicu等[12]的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，大豆苷元可以抑制宮頸癌細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)，并且表現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。綜合前人研究成果[13,14],筆者推測(cè)大豆苷元下調(diào)VEGF-C表達(dá)可能是大豆苷元抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

細(xì)胞的癌變，腫瘤的發(fā)生至少是由幾百種基因異變而引起的，大豆苷元可以通過(guò)一系列的表達(dá)調(diào)控影響癌細(xì)胞，使其功能結(jié)構(gòu)改變而達(dá)到抑制效果。大豆苷元可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖。如：大豆苷元能抑制宮頸癌 Hela 細(xì)胞的生長(zhǎng)并將其阻滯于G0/G1或G2/M期，從而抑制Hela細(xì)胞的增殖[15]。大豆苷元可以通過(guò)線粒體依賴途徑促進(jìn)凋亡，Caspase-3的表達(dá)是細(xì)胞凋亡中的一個(gè)關(guān)鍵因素，大豆苷元可以激活Caspase-4，其結(jié)合白細(xì)胞介素6誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，也可以通過(guò)誘導(dǎo)Caspase-9和Caspase-7的活化以及誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。大豆苷元還可以通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2發(fā)揮促凋亡作用[17～19]。還有研究還表明，大豆苷元處理 Hela 細(xì)胞后，人端粒酶催化亞單位mRNA的表達(dá)下降。大豆苷元還可以通過(guò)降低線粒體膜電位,調(diào)節(jié)下游c-Myc及相關(guān)Myc蛋白激活氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡[20～23]。上述研究表明大豆苷元通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和體內(nèi)端粒酶活性等多個(gè)途徑影響宮頸癌的發(fā)展。本研究結(jié)果揭示了一條大豆苷元抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的新的信號(hào)傳導(dǎo)通路，為今后宮頸癌的防治提供了新的方向。

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