馮五文，王晶，張世洋，唐飛，盛永成，敖慧，彭成

注射用雙黃連（凍干）（以下稱雙黃連凍干粉）是由金銀花、連翹、黃芩制成的臨床常用的廣譜抗病毒中藥注射劑，然而，近年來屢屢發(fā)生的不良反應給雙黃連凍干粉的使用蒙上了陰影。作為一種使用廣泛且不良反應高發(fā)的注射劑品種，雙黃連凍干粉亟需建立有效的質(zhì)量控制方法保障其質(zhì)量。指紋圖譜作為控制中藥注射劑質(zhì)量的重要手段，已被2015版《中國藥典》用于雙黃連凍干粉的質(zhì)量控制，然而，該版藥典僅對7個特征峰進行了控制，難以全面反應雙黃連凍干粉的特征成分。因此，有必要對雙黃連凍干粉建立更有效的指紋圖譜質(zhì)量控制方法。在收集與制備不同雙黃連凍干粉樣品的基礎上，建立雙黃連凍干粉的UPLC指紋圖譜，并結(jié)合相似度分析和聚類分析進行樣品的質(zhì)量分析與評價，為雙黃連凍干粉質(zhì)量控制的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：超高效液相色譜儀（Waters Acquity Ultra Performance LC，美國）；Masslynx 4.1 色譜工作站；ACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（2.1mm ×100 mm；1.8 μm）；Milli-Q超純水機（Millipore，美國）；KQ-5000DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子分析天平（AB135-S，Mettler Toledo，瑞士）。

試劑：乙腈為色譜純（Fisher，美國），磷酸為分析純（北京化工廠），水為哇哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

對照品：綠原酸（MUST-12031402）、隱綠原酸（MUST-11112203）、新綠原酸（MUST-11112203）、異綠原酸A（MUST-11061601）、咖啡酸（MUST-12042405）、異綠原酸B（MUST-11083102）、異綠原酸C（MUST-11081803）、連翹酯苷A（MUST-11052001）、黃芩苷（MUST-11101403）、1,3-二咖啡?？崴幔∕UST-11060601），黃芩素（MUST-10031701）。以上對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。

樣品來源：正常雙黃連樣品（NS1-NS5）、過期雙黃連樣品（GQ1-GQ5）及臨床導致過不良反應的雙黃連樣品（AR1-AR5）由哈藥集團中藥二廠生產(chǎn)。為模擬雙黃連凍干粉運輸儲藏過程可能出現(xiàn)的情況，同時制備了雙黃連凍干粉處理樣品。高溫處理樣品（TS1-TS5）的制備：取正常樣品于60℃恒溫箱中放置10天即得；光照處理樣品（LS1-LS5）的制備：取正常樣品于光照強度4500 ± 500Lx的可調(diào)光源下持續(xù)照射10天制得；暴露處理樣品（ES1-ES5）的制備：取正常樣品，開啟瓶口后放置于室溫避光環(huán)境10 天制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相乙腈（A），0.2%甲酸-水（B）；流速0.2 mL?min-1梯度洗脫；柱溫室溫；檢測波長350nm；進樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0～5 min，8%～10% A；5～10 min，10%～12% A；10～11 min，12%～18% A；11～18 min，18%～25% A；18～24 min，25%～30% A；24～28 min，30%～50% A；28～29 min，50%～100% A。

2.2 對照品及供試品溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取黃芩素、黃芩苷、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、1,3-二咖啡酰奎尼酸對照品適量，置棕色容量瓶中，甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取雙黃連凍干粉粉末適量，置棕色容量瓶中，加水使溶解，制成每1 mL含30 mg固體的溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾即得，置4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別計算各共有峰的保留時間與峰面積RSD值，結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD均小于5%，峰面積的RSD均小于5%，說明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、1、2、4、6、8 h進樣，按2.1項進行色譜條件測定，結(jié)果表明，各共有峰的保留時間和峰面積RSD均小于5%，說明供試品溶液在8小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次樣品，平行制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件測定指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于5%，說明重復性良好。

2.4 樣品測定

取25批正常注射用雙黃連（凍干）樣品，按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖，混合對照品溶液和典型注射用雙黃連（凍干）溶液色譜圖見圖1，所有批次樣品色譜圖見圖2。通過選擇5批正常注射用雙黃連（凍干）樣品，確定了26個共有峰在正常樣品中均有出現(xiàn)。通過對照品指認，確定了其中11個共有峰：新綠原酸（1號峰）、綠原酸（5號峰）、隱綠原酸（6號峰）、咖啡酸（7號峰）、1,3-二咖啡酰奎尼酸及（10號峰）、連翹酯苷A（14號峰）、:異綠原酸B（17號峰）、異綠原酸A（18號峰）、異綠原酸C（19號峰）、黃芩苷（20號峰）、黃芩素（25號峰）。

圖1 注射用雙黃連（凍干）混合標準品與正常樣品色圖譜

圖2 不同批次注射用雙黃連（凍干）化學指紋圖譜

2.5 參照峰的選擇

在各批次注射用雙黃連（凍干）樣品中，20號峰（黃芩苷）保留時間適中，相對峰面積最大，且分離度好，故選擇20號峰為參照峰。在此基礎上，計算各批次樣品中共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 指紋圖譜相似度評價 將測定獲得的30批雙黃連凍干粉指紋圖譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A 版）進行分析，采用5批正常樣品圖譜生成標準對照特征圖譜R。30批樣品與標準對照特征圖譜R的相似度匹配結(jié)果見表1。

表1 雙黃連（凍干）正常樣品與標準對照圖譜R相似度

2.6.2 層次聚類分析 以共有峰的相對峰面積為聚類變量，采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件，對雙黃連正常樣品與特殊處理樣品進行聚類分析。聚類方法采用組間聯(lián)接法，以Euclidean距離為度量標準，以全距從0到1的標準化法進行聚類，聚類結(jié)果見圖3。

4 討論

中藥指紋圖譜評價方法將中藥視為內(nèi)部成分相互聯(lián)系的整體，是從整體的角度出發(fā)控制中藥質(zhì)量的方法，具有能反應中藥多組分、多靶點作用的特點[1,2]。因此，指紋圖譜評價法已被WHO等機構采納用于草藥及制品的質(zhì)量控制?！吨袊幍洹?010版對雙黃連凍干粉的化學成分控制包含了指紋圖譜檢查與成分含量控制，分別采用不同的色譜條件對指紋圖譜和3個指標成分進行檢測，步驟操作繁瑣；目前文獻報道的雙黃連凍干粉指紋圖譜研究主要是采用HPLC法，運行時間一般在100 min左右，具有檢測時間長、特征參比峰少等特點[3-6]，不利于樣品的檢測。UPLC是一種近年來較為常用的色譜分離技術，相對于傳統(tǒng)的HPLC 技術，具有更號的分離度、靈敏度以及分離速度[7,8]。應用UPLC技術，本文建立了雙黃連凍干粉的質(zhì)量控制方法，相對于目前文獻報道的方法，本文建立的方法具有檢測時間更短，特征峰信息更多的特點，能為提高雙黃連凍干粉質(zhì)控水平提供參考。

圖3 不同注射用雙黃連（凍干）聚類分析結(jié)果

為全面地反映所建立方法的有效性，收集了不同類型的雙黃連凍干粉，包括正常樣品、臨床上導致過不良反應的樣品以及過期樣品，并結(jié)合實際儲藏、運輸過程中可能遇到的情況，制備了高溫處理樣品、暴露處理樣品、光照處理樣品。指紋圖譜顯示，特殊樣品的10號峰左右的色譜峰（圖2虛線標記）與正常樣品有較大差異，提示1,3-二咖啡?？崴岬瘸煞只瘜W性質(zhì)不穩(wěn)定，易受光照等影響，其含量差異可用于反應雙黃連凍干粉的質(zhì)量。相似度分析結(jié)果表明，正常樣品色譜圖與標準色譜圖具有較高的相似度（≥0.999），而特殊樣品與標準色譜圖也具有較高的相似度（≥0.997），提示相似度分析不能很好地用于區(qū)分特殊樣品。聚類分析結(jié)果顯示，正常樣品能聚為一類，表明所建立的方法能較好地區(qū)分正常樣品與特殊樣品；同時，不良反應樣品通過聚類分析被聚到不同特殊樣品組中，提示臨床上引發(fā)不良反應的原因與多種因素有關。綜合聚類分析結(jié)果，所建立的方法能較好地區(qū)分正常樣品與特殊樣品，為雙黃連凍干粉質(zhì)量控制方法的提高提供了依據(jù)。