趙學勇，高玥 ，李彥橋，方洋，蘇思雨，張靜波，古銳

過敏性哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，因暴露于過敏原導致間歇性氣喘，氣道高反應性，喘息和咳嗽[1]。過敏性哮喘發(fā)病率高，在全世界范圍內，超過3億人受到這種疾病的影響，過敏性哮喘已經成為工業(yè)化國家和發(fā)展中國家公共衛(wèi)生服務日益增加的負擔。

對于過敏性哮喘的治療，西藥應用的較多，但存在藥物不良反應的難題。中藥具有多成分、多靶點的特點，在治療過敏性哮喘方面可發(fā)揮其作用。三味龍膽花片為一種上市的藏成藥，組方為白花龍膽、甘草、蜂蜜干膏。具有清熱，潤肺的功效，用于治療肺熱氣喘和咽喉炎。本研究擬通過觀察小鼠的引喘潛伏期、ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-4、IFN-γ水平以及肺組織病理，以此來評價三味龍膽花片對于過敏性哮喘的治療效果,為其臨床療效提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

6周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級，由成都達碩實驗動物公司提供，批號：SCXK（川）2015-030。

1.2 實驗藥品及制備

三味龍膽花片由宇妥藏藥股份有限公司提供，批準文號：國藥準字Z20100069，批號：171002。三味龍膽花片高、中、低劑量組的給藥劑量分別為3.43 g﹒kg-1、1.71 g﹒kg-1、0.86 g﹒kg-1，即成人每日劑量的20倍、10倍、5倍。醋酸地塞米松片由國藥集團容生制藥有限公司提供，批號：161016。醋酸地塞米松的給藥劑量為0.05 g﹒kg-1。

1.3 實驗儀器

超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號：ULUP-I；離心機，美國BECKMAN COULTER公司，型號：Allegra X-30R Centrifuge；高級多功能酶標儀，美國Thermo公司，型號：Varioska；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機，常州市中威電子儀器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋機，常州郊區(qū)中威電子儀器廠；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；980型超聲霧化器，上海天緣醫(yī)用生物有限公司。

1.4 實驗試劑

卵清蛋白，美國SIGMA公司，批號：SLBQ9036V；氫氧化鋁凝膠佐劑，美國Thermo公司，批號：SL255649；小鼠白細胞介素4（IL-4）高敏試劑盒，聯(lián)科生物MULTI SCIENCES公司，批號：204H80442；小鼠γ干擾素（IFN-γ）試劑盒，聯(lián)科生物MULTI SCIENCES公司，批號：228080442；羧甲基纖維素鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：20130530；水合氯醛，成都市科龍化工試劑廠，批號：20111123；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：L217071712；磷酸鹽緩沖鹽溶液，biosharp公司，批號：163061。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

6周齡雌性BALB/c小鼠60只，按照體重隨機分為空白對照組，模型組，三味龍膽花片高、中、低劑量組，地塞米松組。于激發(fā)前1h給藥，各組灌胃給藥 7 d，每日 1 次，期間自由飲食。

2.2 建立模型

參照前人方法[2～6]復制過敏性哮喘小鼠模型。2.2.1 致敏液和引喘液的制備卵清蛋白致敏液： 精密稱取卵清蛋白（OVA）0.025 g置于250 mL的容量瓶中用生理鹽水定容至刻度線。取10 mL卵清蛋白生理鹽水溶液于小燒杯中，并將5.6 mL的氫氧化鋁凝膠佐劑緩慢加入卵清蛋白生理鹽水溶液中進行乳化，用于致敏，現配現用。

引喘液：用生理鹽水配制濃度1.5% 的卵清蛋白引喘液（即將1.5 g的卵清蛋白溶于100 mL的生理鹽水中），用于引喘，現配現用。

2.2.2 致敏于第1、8、15天分給模型組、地塞米松組、三味龍膽花片高、中、低劑量組每只小鼠腹腔注射0.16 mL致敏液以致敏，空白對照組用等量的氫氧化鋁凝膠佐劑生理鹽水代替。

2.2.3 激發(fā) 從第19天開始，將模型組、地塞米松組、三味龍膽花片高、中、低劑量組小鼠分別置于密閉容器內，給予1.5% OVA引喘液超聲霧化吸入以激發(fā)?？瞻讓φ战M以生理鹽水進行霧化。每日1次，每次15 min，連續(xù)7 d。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 小鼠狀態(tài)觀察 觀察小鼠的精神、呼吸狀況，飲食、搔鼻抓面情況、體重變化等。

2.3.2 小鼠引喘潛伏期的觀察與測定實驗第19、21、25天分別于霧化激發(fā)時，觀察記錄每只小鼠引喘潛伏期（即從噴入1.5%卵清蛋白液開始至小鼠出現呼吸急促、腹肌收縮凹陷的時間），觀察記錄15分鐘,以“秒”為計算單位，共記錄3次，將3次結果的平均值作為最終結果，若潛伏期超過15min，則引喘潛伏期以900秒計。

2.3.3 ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ末次激發(fā)后3 h，腹腔注射10%水合氯醛25 mL﹒kg-1使小鼠麻醉致死，頸部正中切開，暴露氣管和胸腔，結扎右肺。將靜脈留置套管針插入氣管，拔出針管并結扎氣管，連接注射器，經注射器依次注入0.4 mL、0.3 mL、0.3 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液，每次注入反復抽吸3次，回收支氣管肺泡灌洗液至離心管內，經1500 rpm、4℃離10 min，分離上清液，用于ELISA檢測。BALF上清液按 ELISA 試劑盒說明書操作，在450 nm和570 nm處測吸光度值，通過繪制標準曲線求出標本中IL-4及IFN-γ的實際濃度。

2.3.4 肺組織病理取右側肺組織置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h，經石蠟包埋、組織切片，常規(guī)脫蠟脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后在光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 22.0 軟件對數據進行統(tǒng)計處理。數據資料以均數±標準差（x±S）表示，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，組間比較采用 LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般狀態(tài)

模型組小鼠經抗原刺激后，出現煩躁不安，精神較差，呼吸急促，腹肌凹陷，搔鼻抓面頻繁，飲食和飲水量減少，體重減輕明顯；空白對照組小鼠呼吸均勻平穩(wěn)，無搔鼻抓面，飲食正常，體重增加；三味龍膽花片各組和地塞米松組出現呼吸急促、搔鼻抓面，但頻率和程度均較輕，體重輕微下降。

3.2 小鼠引喘潛伏期

與空白對照組相比，模型組小鼠引喘潛伏期明顯縮短，有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比，三味龍膽花片高、中、低劑量組與地塞米松組引喘潛伏期明顯延長（P＜0.01），實驗結果如表1所示。

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較（±s，n=10）

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較（±s，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 給藥劑量（g﹒kg-1） 引喘潛伏期（s）空白對照組 - 900.00±0.00**模型組 - 202.17±13.74地塞米松組 0.05 408.30±14.66**三味龍膽花片低劑量組 0.86 320.30±28.09**三味龍膽花片中劑量組 1.71 395.73±22.06**三味龍膽花片高劑量組 3.43 406.81±52.25**

3.3 BALF中IL-4、IFN-γ的表達情況

與空白對照組相比，模型組IL-4水平明顯升高，且具有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比，三味龍膽花片低劑量組和中劑量組IL-4水平降低（P＜0.05）；地塞米松組和三味龍膽花片高劑量組IL-4水平明顯降低（P＜0.01）。

與空白對照組相比，模型組IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值降低，具有極顯著性差異（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和三味龍膽花片各劑量組IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值升高，均具有顯著性差異（P＜0.05），具體實驗結果如表2所示。

表2 各組小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表達情況（±s，n=10）

表2 各組小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表達情況（±s，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

組別 給藥劑量（g﹒kg-1）IL-4（pg﹒mL-1）IFN-γ（pg﹒mL-1） IFN-γ/IL-4空白對照組 - 17.56±5.30**496.64±24.54**30.72+8.77**模型組 - 44.76±12.92 304.48±49.85 7.63+3.30地塞米松組 0.05 28.25±8.00** 367.64±41.29* 13.71+3.05**三味龍膽花片低劑量組 0.86 33.68±8.90* 341.20±16.02* 10.70+2.20*三味龍膽花片中劑量組 1.71 32.61±4.73* 347.83±40.00* 10.77+1.22*三味龍膽花片高劑量組 3.43 30.52±4.44** 354.61±45.31* 11.89+2.28**

3.4 肺組織病理學改變

3.4.1肉眼觀察 空白對照組肺組織為淡粉紅色，表面濕潤有光澤，質地柔軟。模型組肺組織顏色暗紅，明顯充血腫大，可見瘀斑淤點。各給藥組肺組織出現片狀紅色，輕度腫大。

3.4.2鏡下觀察 空白對照組肺臟各級支氣管和肺泡結構正常，支氣管纖毛上皮排列整齊；模型組支氣管上皮細胞增生，支氣管管腔內可見較多的粘液分泌物，血管上皮細胞變性、脫落，肺間質水腫，伴有炎性細胞浸潤，局部炎細胞聚集形成不規(guī)則炎性灶，細胞成分增多；地塞米松組和三味龍膽花片各劑量組支氣管管腔內見少量炎性滲出物，支氣管上皮細胞增生，肺間質水腫，伴有少量淋巴細胞浸潤、炎細胞聚集。其中地塞米松組和高劑量組治療效果相對較好。

圖 1 各組小鼠肺組織病理圖片（HE染色 400×）

4 討論

三味龍膽花片為一種上市的藏成藥，組方為白花龍膽、甘草、蜂蜜干膏。具有清熱，潤肺的功效，用于治療肺熱氣喘和咽喉炎。方中白花龍膽為君藥，來源于大花龍膽Gentiana szechenyii Kanitz、岷縣龍膽G. purdomii Marq.、高山龍膽G. algida Pall.的花或花枝，藏名為榜間嘎保[7]?！秷D鑒》記載：白花龍膽生長在草山坡。葉小，花繁盛。味苦，功效治熱性時疫?！惰F螯》中記載：“白花龍膽性涼、味澀，治一切熱病，解毒，利喉?！?/p>

引喘潛伏期能夠評價小鼠暴露于激發(fā)環(huán)境中的癥狀表現。本研究觀察記錄各組小鼠的引喘潛伏期，與模型組相比，三味龍膽花片給藥各組均能顯著延長小鼠的引喘潛伏期。

有研究認為，哮喘和炎癥與IL-4的產生增加和IFN-γ的產生減少有關[8]。過敏性哮喘為Ⅰ型過敏反應。Ⅰ型過敏是由過敏原的特征性免疫反應引起的，主要由Th2細胞介導。IFN-γ主要由Th1分泌，而Th2細胞可分泌IL-4。Th2細胞合成高水平的IL-4，導致過敏原特異性免疫球蛋白（Ig）E的產生和肥大細胞釋放介質。Th1細胞通過分泌IFN-γ來抑制Th2免疫應答。Th1與Th2細胞相互抑制，平衡消長，維持著動態(tài)平衡狀態(tài)。Th1細胞功能下降，一方面會誘發(fā)IFN-γ合成的不足，降低其抑制B細胞的活化和特異性IgE分泌的作用；另一方面將直接導致其抑制Th2細胞發(fā)育的功能減弱，誘發(fā)Th2細胞功能異常增高，導致IL-4、IL-5大量分泌，促進EOS的分化和激活[9]。因此，估計Th1 / Th2細胞因子平衡關系是評估哮喘的重要工具。本研究通過考察支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平，以及計算IFN-γ/ IL-4比值，考察三味龍膽花片對于過敏性哮喘的治療作用。ELISA結果顯示模型組小鼠 IL-4水平升高，IFN-γ水平降低；三味龍膽花片各組均能不同程度地降低IL-4水平，同時升高IFN-γ水平，提示三味龍膽花片對過敏性哮喘的治療作用。

綜上所述，三味龍膽花片可改善小鼠霧化激發(fā)表現、延長小鼠引喘潛伏期、降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4水平、升高IFN-γ水平、改善肺組織病理形態(tài)，提示三味龍膽花片對過敏性哮喘有一定的治療作用，為其臨床療效提供了實驗依據。