吳 斌，許文太，周洪貴（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川南充637000；.解放軍第101醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇無錫14000）

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)也稱“試管嬰兒”技術(shù)，是當(dāng)今治療不孕不育的重要方法，精液優(yōu)化處理作為IVF-ET技術(shù)（ART）的關(guān)鍵步驟之一，其目的是分離出精液中的精漿，除去畸形精子、死精子、細(xì)胞碎片及其他有害的物質(zhì)，最終優(yōu)選出一定數(shù)量成熟且具有受精潛能的前線運(yùn)動(dòng)精子[1]。目前，臨床上常用的優(yōu)選方法主要包括上游法、密度梯度離心（DGC）法等。本研究比較了DGC法、上游法及DGC結(jié)合上游法處理精子的IVF-ET臨床結(jié)局，旨在為優(yōu)化IVF-ET技術(shù)過程中精子處理方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇解放軍第101醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2013年12月至2016年3月施行IVF-ET助孕的共206個(gè)IVF-ET治療周期的患者，對其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入病例的不孕原因包括：盆腔、輸卵管因素、免疫性因素、不明原因[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)為男方中重度精子少、弱、畸形精子癥患者。其中104個(gè)周期采用DGC法處理精液，為實(shí)驗(yàn)1組；30個(gè)周期采用上游法處理精子，為實(shí)驗(yàn)2組；72個(gè)周期采用DGC法結(jié)合上游法處理精子，為實(shí)驗(yàn)3組。

表3 3組患者的IVF-ET結(jié)局比較[%（n/n）]

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 女方給予常規(guī)促排卵方案[3]，待體內(nèi)卵泡發(fā)育成熟后對其注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），劑量為 5 000 U 或 10 000 U，35～36 h后，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下行卵泡穿刺取卵。男方禁欲2～7 d后在女方取卵手術(shù)當(dāng)天通過手淫法取精液[4]，收集于無菌取精杯中，液化后待處理。

1.2.2 DGC法[5]將Isolate精子梯度液（美國Irvine）的下層液（濃度80%）加入15 mL至錐底離心管底部，再將同體積濃度為40%的上層液緩慢置于其上，上下層可見明顯分界面，再沿壁緩慢加入1.5 mL已液化的精液，1 338 r/min離心15 min，棄除上下層梯度液和精漿，精子沉淀物用人輸卵管受精液（HTF，Quinn′s Advantage?Fertilization media）1 092 r/min離心洗滌 2次，棄上層，補(bǔ)充HTF液至1 mL，混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)備用。

1.2.3 上游法[5]將液化后的精液充分混勻后，取1 mL加入5mL的圓底試管底部，在其上分層加入HTF液2mL，將離心管傾斜45°，置入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)上游30～60 min（時(shí)間根據(jù)精液質(zhì)量來調(diào)整），避免晃動(dòng)。用巴士德吸管吸出上層呈云霧狀的液體，移入另一支圓底試管，添加HTF液 2 mL，混勻，1 092 r/min離心 5 min。吸出上清液，加HTF液0.5 mL，輕彈管底，使沉淀松散。分層加入HTF液1 mL，45°傾斜，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)20 min，吸取上部精子懸液，調(diào)整濃度，置入37℃培養(yǎng)箱待受精用。1.2.4 DGC法結(jié)合上游法 先用密度梯度離心液處理，棄除精漿和2層梯度液后，加HTF液2 mL混勻，1 092 r/min離心5 min，棄上清；再加HTF液0.3 mL，輕彈管底，使沉淀松散，分層加入HTF液1 mL，45°傾斜，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30 min，吸取上部精子懸液轉(zhuǎn)入另一支錐底離心管內(nèi)，加HTF液1 mL混勻，調(diào)整精子濃度備用。

1.2.5 體外受精、胚胎培養(yǎng)和移植 3組均于取卵后3～5 h，將優(yōu)化好的精子加入到含有卵子的培養(yǎng)皿中，調(diào)整好精子濃度，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)16～20 h后，機(jī)械法脫顆粒觀察受精情況，第3天觀察卵裂情況并記錄，胚胎評分后行胚胎移植或胚胎冷凍。

1.2.6 胚胎評分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞大小均勻與否、碎片多少等情況，參照2010年美國輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)（SART）的胚胎評分系統(tǒng)[6]進(jìn)行卵裂期胚胎質(zhì)量評分，見表1。評分結(jié)果Ⅰ級或Ⅱ級的為優(yōu)質(zhì)胚胎。受精率=受精胚胎數(shù)/獲卵數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂數(shù)；胚胎種植率=著床胚胎總數(shù)/移植胚胎總數(shù)。移植后28 d B超檢測到孕囊和胎心即為臨床妊娠，臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)。

表1 卵裂期胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3 組患者的基本情況比較 3組患者女方年齡、不孕年限、男方年齡及獲卵數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 3組患者的基本情況比較（±s）

表2 3組患者的基本情況比較（±s）

基本情況女方年齡（歲）不孕年限（年）男方年齡（歲）獲卵數(shù)（個(gè)）實(shí)驗(yàn)1組31.58±3.70 4.53±2.45 32.45±3.80 8.14±5.64實(shí)驗(yàn)2組30.88±3.86 4.80±2.34 31.86±3.50 8.56±5.42實(shí)驗(yàn)3組31.35±3.50 5.49±3.10 32.72±3.45 8.45±6.32

2.2 3 組患者的IVF-ET結(jié)局比較 實(shí)驗(yàn)3組的受精率顯著高于實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高于實(shí)驗(yàn)2組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討 論

精子被多種精液中的多種成分保護(hù)，如精漿、上皮細(xì)胞、未成熟或死的精細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞，甚至細(xì)菌，產(chǎn)生毒素或生物活性物質(zhì)[7]，如去能因子或氧自由基，損害受精能力[8-9]?；谝陨显?，洗滌分離精子是非常必要的。

目前有多種方法用于分離活動(dòng)的且形態(tài)正常的精子用于體外受精，應(yīng)用最廣泛的是DGC法和上游法[10]，上游法的原理是活動(dòng)精子有向上游到培養(yǎng)液中的能力，從而將活動(dòng)精子與死精子、白細(xì)胞及雜質(zhì)分開，其可顯著提高精子活動(dòng)率、存活率、正常形態(tài)百分率，操作簡便，成本低廉，但是精子的回收率低[11]。DGC法的原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或非連續(xù)密度梯度，將精液置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使精子與精液其他組分分層、分離。本研究采用2層濃度分別為80%和40%的非連續(xù)密度梯度離心液，具有不同懸浮密度的細(xì)胞及其他類型的顆粒會(huì)慢慢沉淀至密度較高的溶液，離心將會(huì)加快其沉淀速度，由于DNA濃縮后的成熟精子密度高于80%，因而離心后活動(dòng)力強(qiáng)的成熟精子可以通過這層液體到達(dá)離心管底部，而其他類型的細(xì)胞包括未成熟精子就會(huì)在40%和80%的液體交界面上終止沉淀[1]。已證實(shí)，與上游法比較，DGC法能回收更多形態(tài)正常的精子，并明顯增加精子的活力和體外存活能力，尤其對于重度少、弱及畸形精子癥，冷凍復(fù)蘇后的精液可提高回收率[12-13]。ZINI等[14]和SAKKAS等[15]報(bào)道，DGC法可去除染色體濃縮差和DNA斷裂的精子。EREL等[16]還認(rèn)為處理質(zhì)量較差的精液，DGC法得到精子的存活率、核成熟度和頂體反應(yīng)率均高于上游法。

KARAMAHMUTOGLU等[17]研究使用DGC法結(jié)合上游法處理精液可以提高宮腔內(nèi)人工授精周期的妊娠成功率。XUE等[18]報(bào)道DGC法結(jié)合上游法可以富集畸形精子癥患者的形態(tài)正常、DNA完整的精子。STEVANATO等[19]和GHUMMAN等[20]的研究均顯示DGC法結(jié)合上游法和上游法均可以收集較健康的精子，減少凋亡或DNA損傷的精子。KIM等[21]研究結(jié)果顯示，DGC法結(jié)合上游法與上游法比較，臨床妊娠率并無顯著差異?；谝陨涎芯浚局行睦^續(xù)探索了更理想的精液處理方法，DGC法結(jié)合上游法是在傳統(tǒng)的非連續(xù)密度梯度離心后增加一個(gè)上游篩選過程。結(jié)合了2種精子處理方法的優(yōu)點(diǎn)，精子回收率高且能對回收的精子二次篩選，不增加精子的DNA損傷，從而保證了用于體外受精的精子質(zhì)量。

本研究分析比較了3種精液處理方法的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率，結(jié)果顯示，DGC法結(jié)合上游法的受精率高于單純的DGC法，可能是由于精子穿過2層非連續(xù)梯度液到達(dá)離心管的底部，而精漿被隔離在梯度液上面，精液中影響受精和影響胚胎質(zhì)量的成分被有效地去除，精子沉淀物用受精液離心洗滌1次，也可基本去除沉淀物中的梯度液，最后沉淀精子團(tuán)還可能含有染色體濃縮差和DNA斷裂的精子，接著精子團(tuán)被轉(zhuǎn)入含有HTF液的離心管底部，37℃孵育上游30 min，質(zhì)量較好的精子分布在上層?？偟膩碚f，受精用的上層精子活力相對較好、精漿成分去除較徹底、核成熟度好、染色質(zhì)完整性好。然而，本研究的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，原因可能與本研究例數(shù)較少，抽樣誤差較大有關(guān)，今后需要增加樣本例數(shù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，作者認(rèn)為DGC法結(jié)合上游法能篩選出活力、形態(tài)足夠好和DNA損傷小的精子，值得在IVFET治療中推廣應(yīng)用。

[1]黃國寧.輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：62-63.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)，黃荷鳳.臨床診療指南-輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：33-37.

[3]陳瑞玲，李慶琨，韋相才，等.體外受精-胚胎移植術(shù)中使用冷凍供精及夫精的臨床效果觀察[J].中國男科學(xué)雜志，2003，17（4）：264-266.

[4]BRINSDEN PR.Texmook of in vitro fertilization and assisied reproduction[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：22-234.

[5]World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen[M].5th ed.Cambridge：Cambridge University Press，2010：138-139.

[6]RACOWSKY C，VERNON M，MAYER J，et al.Standardization of grading embryo morphology[J].J Assist Reprod Genet，2010，27（8）：437-439.

[7]ARAKI Y，YAO T，ASAYAMA Y，et al.Single human sperm cryopreservation method using hollow-core agarose capsules[J].Fertil Steril，2015，104（4）：1004-1009.

[8]LYU BN，ISMAILOV SB，ISMAILOV B，et al.Mitochondrial concept of leukemogenesis：key role of oxygen-peroxide effects[J].Theor Biol Med Model，2008，5：23.

[9]FORD WC.Regulation of sperm function by reactive oxygen species[J].Hum Reprod Update，2004，10（5）：387-399.

[10]PRAKASH P，LEYKIN L，CHEN Z，et al.Preparation by differential gradient centrifugation is better than swim up in selecting sperm with normal morphology（strict criteria）[J].Fertil Steril，1998，69（4）：722-726.

[11]ESTEVES SC，SHARMA RK，THOMAS AJ，et al.Improvement in motion characteristics and acrosome status in cryopreserved human spermatozoa by swim-up processing before freezing[J].Hum Reprod，2000，15（10）：2173-2179.

[12]CLAASSENS OE，MENKVELD R，HARRISON KL.Evaluation of three substitutes for Percoll in sperm isolation by density gradient centrifugation[J].Hum Reprod，1998，13（11）：3139-3143.

[13]HERNANDEZ-LOPEZ L，UMLAND N，MONDRAGON-CEBALLO S，et al.Comparison of the effects of percoll and puresperm on the common marmoset semen[J].J Med Primatol，2005，34（2）：86-90.

[14]ZINI A，F(xiàn)INELLI A，PHANG D，et al.Influence of semen processing technique on human sperm DNA integrity[J].Urology，2000，56（6）：1081-1084.

[15]SAKKAS D，MANICARDI GC，TOMLINSON M，et al.The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies[J].Hum Reprod，2000，15（5）：1112-1116.

[16]EREL CT，SENTURK LM，IREZ T，et al.Sperm-preparation techniques for men with normal and abnormal semen analysis.A comparison[J].J Reprod Med，2000，45（11）：917-922.

[17]KARAMAHMUTOGLU H，ERDEM A，ERDEM M，et al.The gradient technique improves success rates in intrauterine insemination cycles of unexplained subfertile couples when compared to swim up technique；a prospective randomized study[J].J Assist Reprod Genet，2014，31（9）：1139-1145.

[18]XUE X，WANG WS，SHI JZ，et al.Efficacy of swim-up versus density gradient centrifugation in improving sperm deformity rate and DNA fragmentation index in semen samples from teratozoospermic patients[J].J Assist Reprod Genet，2014，31（9）：1161-1166.

[19]STEVANATO J，BERTOLLA RP，BARRADAS V，et al.Semen processing by density gradient centrifugation does not improve sperm apoptotic deoxyribonucleic acid fragmentation rates[J].Fertil Steril，2008，90（3）：889-890.

[20]GHUMMAN S，ADIGA SK，UPADHYA D，et al.Combination of swimup and density gradient separation methods effectively eliminate DNA damaged sperm[J].J Turk Ger Gynecol Assoc，2011，12（3）：148-152.

[21]KIM EK，KIM EH，KIM EA，et al.Comparison of the effect of different media on the clinical outcomes of the density-gradient centrifugation/swim-up and swim-up methods[J].Clin Exp Reprod Med，2015，42（1）：22-29.