柳忠玉，雷 健，李曉筱，劉 嬋，覃建兵，許 鋒

(1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025;2.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025)

苯丙烷類物質(zhì)在植物中普遍存在，這類次生代謝產(chǎn)物以羥基芳香環(huán)為共同特征，包括總黃酮、黃酮醇、香豆素、木質(zhì)素、花青素、單寧以及白藜蘆醇等。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)擬南芥、玉米、金魚(yú)草和矮牽牛等植物的研究，發(fā)現(xiàn)了一系列髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(MYB)轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白廣泛參與植物苯丙烷類次生代謝的調(diào)控［1］。MYB也參與調(diào)控藥用植物藥效成分合成，丹參SmMYB39通過(guò)調(diào)控苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響迷迭香酸的合成［2］。水母雪蓮中bHLH和WD40兩種轉(zhuǎn)錄因子形成二元復(fù)合體后，和MYB轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)［3］?？嗍w種子萌發(fā)過(guò)程中子葉中黃酮的積累受FtMyb2與FtMyb3的調(diào)控［4］。在紫外線、傷害和病原菌等脅迫條件下，葡萄VvMYB14和VvMYB15調(diào)控白藜蘆醇合酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響白藜蘆醇的合成［5-6］。

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥，富含白藜蘆醇、類黃酮等藥效成分。其中白藜蘆醇具有顯著抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)等生物學(xué)功能［7］?；⒄雀缓陌邹继J醇、類黃酮等都經(jīng)由苯丙烷類代謝途徑而來(lái)。目前，對(duì)虎杖苯丙烷類代謝的研究多集中在結(jié)構(gòu)基因上，例如查爾酮合酶基因PcCHS［8］、聚酮合成酶基因PcPKS［9-10］等。前期已經(jīng)對(duì)虎杖苯丙烷代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因白藜蘆醇合酶基因PcRS進(jìn)行了功能鑒定［11-12］。而有關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)虎杖苯丙烷類代謝的調(diào)控作用知之甚少。鑒于此，從虎杖葉片中克隆苯丙烷類代謝相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建MYB基因的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，為研究MYB對(duì)虎杖苯丙烷類代謝的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

虎杖植株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心提供。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18－T載體購(gòu)自TaRaKa公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 虎杖葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 以野生虎杖葉片為材料，用Trizol法提取總RNA，用cDNA第1鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 MYB基因保守區(qū)域片段的獲得 對(duì)已經(jīng)公布的苯丙烷類代謝相關(guān)的R2R3－MYB轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物MYBf和MYBr(表1)。以虎杖葉片cDNA為模板進(jìn)行RT－PCR，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并連接至pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行克隆，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性菌落送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PcMYB1基因引物序列

1.2.3 cDNA末端擴(kuò)增 3'RACE 和 5'RACE第1鏈的合成按照Clontech公司試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物(引物序列見(jiàn)表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物并連接至pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。

1.2.4 PcMYB1全長(zhǎng)cDNA拼接及生物信息學(xué)分析將獲得的MYB保守區(qū)域片段和兩端序列進(jìn)行拼接，獲得PcMYB1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。將PcMYB1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST工具進(jìn)行同源分析;利用ORF(Open reading frame)finder軟件尋找開(kāi)放閱讀框;利用Protparam軟件分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì);采用SWISS－MODELSOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用軟件DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì);利用軟件ClustalX 2.1和MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用作同源性和進(jìn)化樹(shù)分析的序列均來(lái)源于GenBank，具體情況列于表2。

1.2.5 PcMYB1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)原核表達(dá)載體pET28a和PcMYB1基因cDNA序列信息，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物ORFf和ORFr擴(kuò)增該基因ORF。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性 30 s、59℃退火 30 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。用BamHⅠ和HindⅢ分別酶切 PCR回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET28a，用T4 DNA連接酶連接回收純化的目的片段和切開(kāi)的載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切以及測(cè)序鑒定后獲得的陽(yáng)性克隆即為重組原核表達(dá)載體，并命名為 pET28a－Pc-MYB1。

表2 多重序列比較和進(jìn)化分析所用MYB蛋白

1.2.6 重組菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a－PcMYB1轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，得到重組菌pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)。挑取單菌落接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。次日以1%量接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600約為 0.5時(shí)，吸出1 mL菌液作對(duì)照，其余加入IPTG(終濃度為 0.5 mmol/L)，誘導(dǎo)3 h后，收集1 mL菌液，將收集的菌液于4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入200 μL PBS緩沖液，充分混勻后加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，4℃冷卻。取15 μL樣品上樣，12%SDS－PAGE電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色，最后成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖PcMYB1基因cDNA全長(zhǎng)的獲得及序列分析

提取虎杖葉片總RNA用于RT－PCR，利用簡(jiǎn)并引物MYBf和MYBr，以cDNA為模板擴(kuò)增MYB基因保守區(qū)域，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序得到1個(gè)長(zhǎng)336 bp的保守區(qū)域片段(圖1－A)。設(shè)計(jì)特異引物3'GSP1和3'GSP2，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行3'RACE，擴(kuò)增得到1個(gè)長(zhǎng)1 056 bp的帶有多聚A尾巴的片段(圖1－B)。設(shè)計(jì)特異引物5'GSP1和5'GSP2，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行5'RACE，擴(kuò)增得到1個(gè)長(zhǎng)398 bp的片段(圖1－C)。將獲得的兩端序列與保守區(qū)域片段序列進(jìn)行拼接得到1段長(zhǎng)1 152 bp的cDNA序列，命名該基因?yàn)?PcMYB1(GenBank登錄號(hào)為KY495789)。

圖1 PcMYB1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

序列分析表明，PcMYB1基因的5'端有長(zhǎng)度為190 bp的非編碼區(qū)，3'端有長(zhǎng)度為149 bp的非編碼區(qū)，開(kāi)放閱讀框ORF由813個(gè)核苷酸組成，編碼1個(gè)含有270個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖2)。利用ExPASy軟件的Protparam預(yù)測(cè)PcMYB1編碼蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白質(zhì)分子式為C1325H2095N395O403S14，總原子數(shù)為4 232，分子質(zhì)量為 30.455 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為8.6。采用 SWISS－MODELSOPMA 進(jìn)行PcMYB1編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，PcMYB1編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋占24.07%、延伸鏈占13.70%、β 轉(zhuǎn)角占 6.67%、無(wú)規(guī)則卷曲占 55.56%。

2.2 虎杖PcMYB1蛋白的同源性分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為研究PcMYB1蛋白與其他MYB蛋白的進(jìn)化關(guān)系，選取擬南芥次生代謝調(diào)控相關(guān)的MYB亞家族(Sg3、Sg4、Sg5、Sg6、Sg7)蛋白以及來(lái)源于其他植物的典型Sg4亞家族成員，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，PcMYB1和葡萄的VvMYB4a、桉樹(shù)的EgMYB1、矮牽牛的 PhMYB4、玉米的 ZmMYB31、柳枝稷的PvMYB4a、擬南芥的AtMYB4和AtMYB32等轉(zhuǎn)錄因子聚類到Sg4亞家族(圖3)，說(shuō)明PcMYB1蛋白是Sg4亞家族MYB蛋白。利用BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，虎杖 PcMYB1與矮牽牛 PhMYB4(ADX33331)、葡萄 VvMYB4a(ABL61515)、桉樹(shù)EgMYB1(CAE09058)、擬南芥 AtMYB4(AAC83582)、玉米 ZmMYB31(NP_001105949)、柳枝稷 PvMYB4a(AEM17348)、擬南芥 AtMYB32(NP_195225)有著較高的同源性，分別為67%、64%、63%、59%、58%、58%、56%。

圖2 PcMYB1基因的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列

圖3 PcMYB1與其他物種MYB氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，虎杖PcMYB1蛋白與其他MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守區(qū)域主要集中在N端，虎杖PcMYB1蛋白在N端具有2個(gè)典型的MYB DNA結(jié)合域，即R2、R3結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3－MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖4)。結(jié)果表明，PcMYB1蛋白符合R2R3－MYB類轉(zhuǎn)錄因子的特征。在PcMYB1蛋白的C端區(qū)域具有4個(gè)典型的Sg4亞家族的保守基序(圖4):C1基序LLsrGIDPX［T/S］HRX［I/L］，C2基序pdLNL［D/E］LXI［G/S］，C3 基序CX1－2CX7－12CX1－2C，C4 基序 FLGLX4－7L［D/G］［F/Y］［R/S］XLEMK，其中 C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］為典型的抑制結(jié)構(gòu)域。

2.3 原核表達(dá)載體pET28a－PcMYB1的構(gòu)建

將PcMYB1基因的ORF區(qū)域(813 bp)構(gòu)建到載體 pET28a中，獲得原核表達(dá)載體 pET28a－PcMYB1。對(duì)原核表達(dá)載體pET28a－PcMYB1進(jìn)行菌液PCR鑒定，獲得1條800 bp左右特異性片段(圖5－A)。將原核表達(dá)載體pET28a－PcMYB1用BamHⅠ和HindⅢ酶切，切出大小約800 bp的片段，該片段為PcMYB1基因的ORF片段，如圖5－B箭頭所示。同時(shí)測(cè)序結(jié)果表明，連入表達(dá)載體pET28a中的PcMYB1基因片段與目的序列一致，未出現(xiàn)堿基突變和移碼現(xiàn)象。將pET28a－PcMYB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)后，得到重組菌pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)。

2.4 重組菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)

PcMYB1基因的ORF由270個(gè)氨基酸組成，理論蛋白分子質(zhì)量為30.455 ku，融合His－Tag標(biāo)簽后理論分子質(zhì)量為31.28 ku。由12%SDS－PAGE電泳結(jié)果可知(圖6)，與未誘導(dǎo)的重組菌pET28a－Pc-MYB1/BL21(DE3)相比，IPTG誘導(dǎo)的重組菌在31 ku左右處出現(xiàn)特異條帶，特異條帶的大小與理論值相符。結(jié)果表明，重組菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)已成功表達(dá)目的蛋白PcMYB1(如圖6箭頭所示)。

圖6 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)誘導(dǎo)產(chǎn)物的SDS－PAGE電泳分析

3 結(jié)論與討論

植物MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)域都是高度保守的，該結(jié)構(gòu)域由1～3個(gè)串聯(lián)的且不完全重復(fù)的R結(jié)構(gòu)(R1、R2、R3)組成，而且絕大多數(shù)植物中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子是含2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3－MYB蛋白［13-14］。對(duì)于基因組大、尚未完成基因組測(cè)序的物種，采用同源克隆的方法研究重要功能基因是一種可行的方法。本研究基于同源克隆的策略，從虎杖葉片成功克隆1個(gè)R2R3－MYB同源基因，命名為PcMYB1，以便研究PcMYB1基因的功能及其對(duì)虎杖苯丙烷代謝的調(diào)控作用。

根據(jù)C端功能基序的不同，MYB轉(zhuǎn)錄因子被分成了 28個(gè)亞家族［1，15］。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，虎杖PcMYB1蛋白和 Sg4亞家族的 AtMYB4、AtMYB32、VvMYB4a、EgMYB1、PhMYB4、ZmMYB31、PvMYB4a等聚為一類，說(shuō)明PcMYB1編碼蛋白屬于Sg4亞家族。來(lái)自Sg4亞家族的AtMYB4是擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)R2R3類負(fù)調(diào)控因子，該因子通過(guò)靶向抑制類黃酮物質(zhì)芥子酸酯合成關(guān)鍵基因C4H來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)植物對(duì)UV－B的耐受性［16］。AtMYB4蛋白的 C末端有1個(gè)抑制結(jié)構(gòu)域 C2 基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］，AtMYB4蛋白可能通過(guò)直接與靶基因結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，或同時(shí)作為其他激活因子的競(jìng)爭(zhēng)者來(lái)抑制靶基因的表達(dá)。C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］也存在于Sg4亞家族的其他負(fù)調(diào)控因子(AtMYB32、VvMYB4a、EgMYB1、PhMYB4、ZmMYB31、PvMYB4a等 ) 中。 其 中 AtMYB32［17］、EgMYB1［18-19］、Zm-MYB31［20］、PvMYB4a［21］被鑒定為在木質(zhì)素生物合成中起轉(zhuǎn)錄抑制作用。矮牽牛PhMYB4通過(guò)負(fù)調(diào)控查爾酮合酶基因PhCHS的表達(dá)，進(jìn)而影響類黃酮的合成［22］。葡萄VvMYB4a也被證實(shí)在其介導(dǎo)的相關(guān)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［23］。Xu等［24］在裸子植物銀杏中也發(fā)現(xiàn)類似于AtMYB4的轉(zhuǎn)錄抑制子GbMYBF2，其在擬南芥中的過(guò)表達(dá)能顯著抑制花青素及黃酮類物質(zhì)的生成。由此可見(jiàn)，眾多研究已表明，含有抑制結(jié)構(gòu)域C2基序pdLNL［D/E］LXI［G/S］的MYB轉(zhuǎn)錄因子在苯丙烷類(木質(zhì)素、黃酮、花青素等)合成中起轉(zhuǎn)錄抑制作用。本研究得到的虎杖PcMYB1蛋白同樣具有抑制結(jié)構(gòu)域C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］，因此，推測(cè)PcMYB1蛋白是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，但其表達(dá)特性與調(diào)控模式，還需要進(jìn)一步轉(zhuǎn)化模式植物加以驗(yàn)證。

MYB轉(zhuǎn)錄因子可以與多種順式作用元件結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)。目前，多采用體外凝膠遷移(EMSA)來(lái)鑒定蛋白質(zhì)與元件的作用情況［25］。本研究已經(jīng)構(gòu)建含有PcMYB1基因的重組質(zhì)粒并且在大腸桿菌中成功表達(dá)目標(biāo)蛋白。后續(xù)將純化該蛋白，用于EMSA鑒定PcMYB1蛋白與元件的作用情況，有利于進(jìn)一步研究虎杖轉(zhuǎn)錄因子PcMYB1蛋白的分子生物學(xué)功能。目前，對(duì)虎杖苯丙烷類代謝中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能知之甚少，本研究的開(kāi)展為虎杖苯丙烷類代謝的深入理解奠定基礎(chǔ)。

本研究從虎杖葉片中成功克隆了1個(gè)R2R3－MYB類轉(zhuǎn)錄因子PcMYB1基因，PcMYB1基因含有長(zhǎng)為813 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼270個(gè)氨基酸殘基?；⒄萈cMYB1屬于Sg4亞家族，序列的C端存在1個(gè)抑制結(jié)構(gòu)域 C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］?；⒄萈cMYB1與已知的矮牽牛PhMYB4序列相似性最高。構(gòu)建了PcMYB1的原核表達(dá)載體pET28a－Pc-MYB1，并在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中成功表達(dá)。

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