賈 鵬， 劉 未， 劉 生， 高 巍

(中國人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心骨科， 天津 300162)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid Arthritis，RA)是一種全身炎癥性自身免疫性疾病，涉及多個(gè)系統(tǒng)，累及多個(gè)關(guān)節(jié)，主要靶組織是關(guān)節(jié)滑膜，主要臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)功能下降、腫脹、疼痛，病變會持續(xù)反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的身心健康，降低生活質(zhì)量[1]。RA多發(fā)于30歲以后，女性發(fā)病率高于男性。RA沒有明確的發(fā)病機(jī)制，可能涉及內(nèi)分泌、遺傳和感染等因素，臨床也沒有發(fā)現(xiàn)特效治療藥物?？刂铺弁词荝A治療的首要環(huán)節(jié)，也是判定藥物療效的標(biāo)準(zhǔn)之一。中藥組方痹腫消湯、益氣解毒化瘀湯具有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，其單味中藥白花蛇舌草(hedyotis diffusa Willd., HD)具有治療RA相關(guān)的抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，本研究采用Ⅱ型膠原蛋白建立膠原誘導(dǎo)性(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，給予白花蛇舌草進(jìn)行治療，觀察其對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響，以期為臨床RA治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品

雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)室溫25℃左右，明暗交替12 h，自由攝食飲水。弗氏完全佐劑(FAC，SIGMA公司)、Ⅱ型膠原蛋白(SIGMA公司)、白花蛇舌草片(天津市中藥飲片廠，國藥準(zhǔn)字Z36020632)、雷公藤多苷片(福建匯天生物藥業(yè)有限公司)。TNF-α試劑盒(上?；鈱?shí)業(yè)有限公司)、IL-Iβ試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、PGE2試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)、RANKL試劑盒(上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司)、0PG試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)。

1.2 分組、給藥

60只大鼠，按體重隨機(jī)分為對照組、模型組、雷公藤多苷6 mg/kg組、白花蛇舌草3、6、12 g/kg組，每組10只。除對照組外，將Ⅱ型膠原蛋白用弗氏完全佐劑(FAC)配成3.0 mg/ml的乳化劑，在大鼠距離尾巴根部2 cm背部皮內(nèi)注射乳化劑，200 μl/只，并于第7日在大鼠距離尾巴根部2 cm背部皮內(nèi)注射乳化劑100 μl/只進(jìn)行二次免疫，復(fù)制大鼠CIA模型[2-4]。其中，對照組大鼠在相同部位相同間隔時(shí)間注射同等體積的生理鹽水。造模的當(dāng)日開始給藥，對照組、模型組大鼠給予同容積生理鹽水。所有大鼠每天稱重，按體重灌胃給藥，給藥體積5 ml/kg，連續(xù)給藥4周。模型組初次免疫21 d，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分為6分及以上可判定造模成功。

1.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)測定

測定各組大鼠治療后1～4周時(shí)的關(guān)節(jié)炎指數(shù)。大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)炎癥一般出現(xiàn)在初次注射膠原后2周左右，3周左右最為明顯，腫脹持續(xù)時(shí)間5～8周。注射膠原的后肢首先出現(xiàn)紅腫，其余肢體相繼受累。大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀表現(xiàn)為食欲減退，體重下降，毛發(fā)無光澤。關(guān)節(jié)炎病變嚴(yán)重程度用關(guān)節(jié)炎指數(shù)表示。大鼠關(guān)節(jié)炎采用0～4級關(guān)節(jié)評分法，根據(jù)受累關(guān)節(jié)紅腫程度以及腫大、變形情況進(jìn)行評分。大鼠關(guān)節(jié)炎0～4級關(guān)節(jié)評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無腫脹；1分，足小趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微腫脹；2分，小趾關(guān)節(jié)以及足跖腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪出現(xiàn)腫脹；4分： 踝關(guān)節(jié)及其他所有趾甲、關(guān)節(jié)全部腫脹。采用評定標(biāo)準(zhǔn)對大鼠四肢關(guān)節(jié)進(jìn)行評定，關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)為四個(gè)關(guān)節(jié)病變評分總和，最高計(jì)16分。

1.4 熱痛閾測定

測定各組大鼠治療前、治療后1～4周時(shí)的熱痛閾值。使用光照鼠尾測痛儀，測定造模前，造模后各時(shí)間點(diǎn)大鼠熱痛閾值。鼠尾測痛儀溫度調(diào)整為55℃，將大鼠鼠尾放入凹槽內(nèi)，于距鼠尾尖0.5 cm處連續(xù)照射，大鼠由照射開始到鼠尾甩動的時(shí)間即為大鼠的熱痛閾。

1.5 血漿炎性因子IL-lβ、TNF-α、PGE2、RANKL 和OPG水平測定

大鼠治療4周時(shí)，大鼠麻醉，固定，剖開腹腔，游離腹主動脈，用一次性注射器腹主動脈穿刺取血， 5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，-20℃凍存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品中IL-lβ、TNF-α、PGE2、RANKL 和OPG水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

與對照組比較，模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組和白花蛇舌草高劑量組給藥2周開始關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低(P<0.05)，白花蛇舌草低、中劑量組給藥3周開始關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低(P<0.05，表1)。

GroupWeeks of treatment1 week2 week3 week4 weekControl 0 0 0 0Vehicle9.40±0.97??8.60±0.84??7.80±1.99??7.10±1.97??GTW9.10±0.997.50±1.08#6.00±1.49#5.00±0.94##HD low dose8.80±1.148.10±2.226.00±1.56#5.20±1.23#HD middle dose9.00±1.337.60±1.515.60±1.65#4.90±1.45#HD high dose8.70±1.257.30±1.42#5.70±1.83#4.80±1.14##

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group

2.2 白花蛇舌草對關(guān)節(jié)炎大鼠熱痛閾的影響

與對照組比較，模型組大鼠造模1周開始熱痛閾值明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組和白花蛇舌草高劑量組給藥2周開始熱痛閾明顯升高(P<0.05)；白花蛇舌草低、中劑量組給藥3周開始熱痛閾明顯升高(P<0.05，表2)。

GroupWeeks of treatment0 week1 week2 week3 week4 weekControl16.9±1.516.6±1.816.7±1.417.1±1.416.8±1.9Vehicle17.1±1.910.9±1.7??9.2±1.1??8.7±1.4??8.2±1.3??GTW17.0±1.810.7±1.811.1±2.0#12.5±1.6##13.5±2.0##HD low dose17.1±2.010.8±1.410.1±1.010.5±1.8#Δ10.2±1.5#ΔΔHD middle dose17.2±2.111.1±1.710.5±1.810.6±1.7#Δ11.2±1.8##ΔHD high dose17.3±1.811.0±1.911.4±2.8#11.7±2.7##14.0±2.4##▲▲○○

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsGTW group;▲▲P<0.01vsHD low dose group;○○P<0.01vsHD middle dose group

2.3 白花蛇舌草對關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-1β、PGE2水平的影響

與對照組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，雷公藤多苷組、白花蛇舌草各劑量組血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平明顯降低(P<0.05，表3)。

GroupTNF-α IL-1βPGE2Control21.42±3.3811.27±2.9575.5±12.4Vehicle63.59±8.06??55.35±7.16??213.4±18.7??GTW46.67±5.19##41.61±5.47##159.0±12.6##HD low dose54.53±7.12#Δ49.25±7.67Δ169.5±21.5##HD middle dose50.87±6.47##47.97±7.14#Δ163.8±13.9##HD high dose40.24±4.40##ΔΔ▲▲○○39.82±8.22##▲○138.0±16.9##ΔΔ▲▲○○

TNF-α: Tumor necrosis factor α； IL-1β: Interleukin 1β; PGE2: Prostaglandin

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05vsGTW group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD low dose group;○P<0.05,○○P<0.01vsHD middle dose group

2.4 白花蛇舌草對關(guān)節(jié)炎大鼠RANKL及OPG水平的影響

與對照組相比，模型組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷組、白花蛇舌草各劑量組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG水平顯著降低(P< 0.05，表4)。

GroupRANKL(pg/ml)OPG(pg/ml)RANKL/OPG(%)Control11.8±2.012.1±2.41.00Vehicke96.7±15.7??71.7±10.5??1.35??GTW52.5±8.6##52.7±8.1##1.03##HD low dose58.7±9.5##60.6±5.8##Δ0.98##HD middle dose54.4±8.5##54.3±6.2##▲1.02##HD high dose47.4±7.6##▲▲50.0±7.1##▲▲0.97##

RANKL: Receptor activator for nuclear factor-kappa B ligand; OPG: Osteoprotegerin

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsvehicke group;

ΔP<0.05vsGTW group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD low dose group

3 討論

RA是一種臨床常見的慢性自身免疫性疾病，細(xì)胞因子在RA發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后及藥物干預(yù)過程中發(fā)揮著重要的作用，是引起RA損傷的重要介質(zhì)[5]。II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀和免疫特點(diǎn)與人類關(guān)節(jié)炎相近。

TNF-α、IL-1β是RA發(fā)病過程中重要的炎性因子，可以與細(xì)胞膜上Toll樣蛋白受體結(jié)合，識別TNF受體，使I-κB磷酸化，從而激活核因子κB，啟動相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄程序，參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。TNF-α、IL-1β能夠誘導(dǎo)IL-6的合成，促進(jìn)IL-6分泌，從而提高滑膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞中NF-κB活化因子配體的釋放，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成因子的表達(dá)。因此，抑制TNF-α、IL-1β的合成對控制RA進(jìn)展具有重要意義。TNF-a由滑膜、軟骨血管翳的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠向上調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞中的細(xì)胞因子、PGE2等。IL-1對于滑膜細(xì)胞及浸潤的淋巴細(xì)胞具有增殖和分化作用，有助于促進(jìn)花生四烯酸的生成，可導(dǎo)致PGE2及膠原酶的合成與釋放[6]。

RA骨折風(fēng)險(xiǎn)增高，主要原因就是骨破壞，在RA早期如何有效地抑制或延緩骨破壞的發(fā)生、發(fā)展是RA防治的重點(diǎn)。破骨細(xì)胞在RA骨破壞機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，破骨細(xì)胞分化因子RANKL和破骨素OPG是調(diào)控破骨細(xì)胞激活、分化、骨吸收活性的核心因子。RANKL可以與破骨細(xì)胞分化因子受體結(jié)合刺激破骨細(xì)胞的分化、增殖，并抑制其凋亡[7]；OPG是腫瘤壞死因子受體超家族中一員[8]，是一種可溶性蛋白質(zhì)，是RANKL的天然阻斷受體，能競爭性的結(jié)合RANKL，阻斷其與受體的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化、增殖，RANKL/OPG環(huán)路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要途徑。RA患者血液、關(guān)節(jié)滑膜液RANKL水平增高，OPG水平降低[9]。本研究模型組大鼠血液RANKL、OPG和RANKL/OPG水平與對照組比較均顯著升高，說明該時(shí)間段RA大鼠誘導(dǎo)骨破壞的關(guān)鍵因子占主導(dǎo)地位，同時(shí)具有骨保護(hù)的因素也在升高，RANKL/OPG比值顯著升高說明RANKL升高的幅度大于OPG升高的幅度，骨破壞是增加的。

疼痛是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最突出的癥狀，檢測指標(biāo)有熱痛和機(jī)械痛，本實(shí)驗(yàn)檢測熱痛。痛閾是目前被廣泛采用以判斷鎮(zhèn)痛效果的指標(biāo)。當(dāng)免疫功能異常時(shí)，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放出TNF-α、IL-1β等多種致痛物質(zhì)，一方面可以直接作用于痛覺神經(jīng)元，增加其興奮性，向高級中樞傳遞疼痛信號，另一方面可以降低神經(jīng)元的興奮閾值，造成中樞敏化，使激活傷害性感受器的刺激強(qiáng)度降低。此外，這些細(xì)胞因子還可以作用于膠質(zhì)細(xì)胞本身，產(chǎn)生正反饋?zhàn)饔茫M(jìn)一步增加細(xì)胞因子的數(shù)量，造成持續(xù)性疼痛。TNF-α、IL-1β在脊髓痛覺調(diào)制中起重要作用。內(nèi)源性TNF-α參與大鼠早期痛覺超敏的發(fā)生，將外源性TNF-α導(dǎo)入正常SD大鼠L5DRG中，TNF-α?xí)l(fā)疼痛，誘發(fā)痛覺超敏。Wistar大鼠鞘內(nèi)注射IL-1β會誘發(fā)痛覺超敏，脊髓中IL-1β可以通過增加NR1亞基的磷酸化來易化疼痛。IL-1β也可在環(huán)氧化酶的作用下，上調(diào)脊髓中致痛物質(zhì)PGE2的表達(dá)。

雷公藤多苷是傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要有效成分，具有強(qiáng)大的抗炎以及免疫抑制作用，已廣泛應(yīng)用于臨床治療多種自身免疫性疾病[10]，這里作為陽性對照藥。

白花蛇舌草為清熱解毒藥，是痹腫消湯中的君藥之一，具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、保肝利膽等生物活性。白花蛇舌草治療RA主要包括調(diào)節(jié)免疫，下調(diào)炎癥因子水平，抑制血管新生等作用，對RA患者體外滑膜細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草可明顯降低RA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)、升高痛閾，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性的作用趨勢，此作用與下調(diào)血液TNF-α、IL-1β和PGE2水平，抑制RANKL、OPG、RANKL/OPG水平，從而達(dá)到有效防治大鼠RA的目的。