王益敏 易增興 林世清 張嘉明 蔡 哲 賀秋蘭 魏 明 孫來?！?鄒學(xué)農(nóng)

（1惠州市中大惠亞醫(yī)院麻醉科，惠州516081；2宜春學(xué)院 江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜春336000；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州 510080；4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科學(xué)研究所，廣州 510700）

持續(xù)或復(fù)發(fā)時(shí)間超過3～6個(gè)月的疼痛稱為慢性疼痛，與一般傷害不同，它失去了生理性疼痛感受的警示作用[1]。腰腿痛是非常常見的慢性疼痛，發(fā)病率大約在20%～30%，且具有年輕化趨勢，嚴(yán)重影響著人們的工作和生活，造成了沉重的社會負(fù)擔(dān)，而造成腰腿痛最主要的病因是腰椎間盤突出癥(lumbar intervertebral disc herniation, LDH)，治療LDH誘發(fā)的慢性腰腿痛是當(dāng)前急需解決的問題。以往認(rèn)為突出的髓核壓迫神經(jīng)根是LDH引發(fā)腰腿痛的主要原因，現(xiàn)在更多觀點(diǎn)指出，它是因?yàn)橥怀鏊韬苏T發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致疼痛外周和中樞敏感化。本課題組前期研究表明，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)NOS，COX-2，3型酸敏感性離子通道及CGRP受體1等參與了外周敏化的調(diào)節(jié)機(jī)制[2]。膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要支持細(xì)胞，但其致炎效應(yīng)與中樞敏化的內(nèi)在聯(lián)系，以及它在誘發(fā)炎癥性疼痛中發(fā)揮的作用，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探索脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子參與誘導(dǎo)髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛，為臨床治療腰椎間盤突出導(dǎo)致的慢性腰腿痛提供理論依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性成年SD大鼠150只，體重220～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。分籠飼養(yǎng),室溫 (20±2)℃ , 維持大鼠12/12晝夜交替(每天8:00～20:00光照)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守中山大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用的規(guī)定。

2.主要試劑及儀器

兔抗鼠p38 MAPK一抗(AF6456)、兔抗鼠p-p38 MAPK一抗(Thr180)購自美國Af fi nity公司；兔抗鼠小膠質(zhì)細(xì)胞一抗OX-42 (Ab1211)購自美國abcam公司，兔抗鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞一抗GFAP (3670P)購自美國Cell Signaling公司，兔抗鼠神經(jīng)元細(xì)胞一抗NeuN (NBP1-92693)購自美國NOVUS公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔(GB23303)、FITC山羊抗小鼠熒光二抗(GB22301)、EDTA (PH 9.0)抗原修復(fù)液(G1203)購自武漢谷歌生物科技有限公司；SB203580購自廣州天駿生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-SR)購自日本尼康公司，von Frey纖毛儀購自美國Stoelting公司。

3. 動(dòng)物模型建立、分組及處理

（1）動(dòng)物模型建立：參照文獻(xiàn)[3]建立動(dòng)物模型，10%水合氯醛麻醉大鼠 (3.5 ml/kg, i.p.)，以髂嵴最高點(diǎn)連線為中心做30 mm左右正中切口，咬除左側(cè)L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)，止血后用無菌生理鹽水沖洗傷口。取鼠尾近段根部2個(gè)節(jié)段自體髓核，置于L5背根神經(jīng)節(jié)上。將PE-10導(dǎo)管向頭側(cè)硬膜外腔輕柔置入約4 mm，另一端經(jīng)皮下隧道，從頸后引出固定并封管，止血后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，用2%利多卡因10 μl 判斷導(dǎo)管位置。Sham 組取髓核組織但不將其置于背根神經(jīng)節(jié)上，余操作同前。

（2）動(dòng)物分組及處理：150只雄性SD大鼠分為兩個(gè)部分，第一部分66只采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組（Blank組，12只）、假手術(shù)組（Sham組，12只）、模型組（NP組，42只），檢測所有大鼠術(shù)前1天，術(shù)后1、3、7、12、14、21和28天的50% MWT。Blank組和Sham組于術(shù)后3天，NP組于術(shù)后1、3、7、14、28天取L4～6脊髓背角，免疫熒光檢測膠質(zhì)細(xì)胞和p-p38表達(dá)及變化，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測膠質(zhì)細(xì)胞與p-p38共表達(dá)情況。第二部分84只分為Blank組（12只）、Sham組（12只）、NP組（12只）、溶劑對照組（DMSO組，12只）和p38MAPK抑制劑SB203580組（SB組，36只），DMSO組和SB組于術(shù)后第2天經(jīng)硬膜外腔分別注射50 μl 10% DMSO和0.1% SB203580。檢測所有大鼠術(shù)前1天，術(shù)后1 d，給藥后1 h、3 h、5 h、7 h、12 h、24 h的50% MWT。其中Blank組，Sham組和NP組于術(shù)后2 d，DMSO組于給藥后3h，SB組于藥后 3 h、7 h、12 h、24 h取術(shù)側(cè)腰段 L4～6脊髓背角，通過 Western blot技術(shù)檢測p-p38 MAPK及p38 MAPK蛋白的表達(dá)。

4. 50% 機(jī)械痛縮足閾值 (50% mechanical withdrawal threshold, 50% MWT)測定

制模前，每日9:00～16:00將大鼠放于有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)環(huán)境，并測定術(shù)前一天的基礎(chǔ)值。術(shù)后行為學(xué)測試時(shí)間定于9:00～16:00 進(jìn)行, 測試前所有大鼠均置于玻璃箱中適應(yīng)30 min，待安靜后開始進(jìn)行測試。根據(jù) Chaplan 等[4]報(bào)道的方法稍加改進(jìn)檢測50% MWT：大鼠在透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)自由活動(dòng), 待安靜后以不同折力的 von Frey 纖毛刺激大鼠足底，避開肉墊使之稍成S形，每次持續(xù)6～8 s。大鼠后肢迅速畏縮或撤回，認(rèn)為是陽性反應(yīng)。從 2 g開始 , 當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級的力度進(jìn)行刺激；如果出現(xiàn)陽性反應(yīng)則予相鄰小一級力度的刺激，連續(xù)進(jìn)行，每個(gè)強(qiáng)度反復(fù)刺激5次，將出現(xiàn)3次以上陽性反應(yīng)的最小von Frey纖維強(qiáng)度定為大鼠的50% MWT。兩次刺激之間至少間隔15 s。

5. 免疫熒光檢測膠質(zhì)細(xì)胞及p-p38MAPK激活及表達(dá)含量

大鼠在選定時(shí)間點(diǎn)以20%烏拉坦深麻醉下經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注400 ml生理鹽水后，繼而4%多聚甲醛灌注固定30 min。將L4-6脊髓節(jié)段取出，4%多聚甲醛后固定24 h，然后依次用10%、20%和30%蔗糖溶液梯度脫水3天。做連續(xù)冠狀冰凍切片(10 μm/片)，切片依次脫蠟、孵育、水洗、浸泡、抗原修復(fù)后分別加入OX-42 (1:200)，GFAP (1:300)，NeuN (1:400)，p-p38MAPK一抗 (1:1 000)，4℃孵育48 h, 水洗、孵育后 DAB 顯色、 蘇木素復(fù)染，透明、封片。熒光雙標(biāo)染色的切片同時(shí)加入兩種不同種屬來源的單克隆一抗混合孵育，隨后再添加各自的熒光二抗混合液進(jìn)行孵育。Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫熒光方法：每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)100倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。采用尼康倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像（紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm）。DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光或者綠光。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件將熒光照片轉(zhuǎn)換為黑白圖片然后選取相同的黑色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值 (integrated optical density, IOD)?

6. Western blot檢測給藥后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓背角p38MAPK及p-p38MAPK蛋白

分別配置5%濃縮膠和10%分離膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，按每孔相同蛋白量（30 μl）上樣進(jìn)行電泳（恒壓80 V 40 min，120 V 1.5 h）。然后再將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流250 mA 1 h）。5%脫脂牛奶封閉3小時(shí)，兔抗鼠p38 MAPK及p-p38MAPK一抗(1:1 000) 4℃孵育過夜。TBS洗膜3次，每次5 min。再加入二抗(l:2 500)，室溫下孵育l h。TBST洗膜，3×10 min。將膜與ECL試劑反應(yīng)后，在暗房中依次壓片、顯影、定影。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。用Levene法檢測各組樣本方差是否齊性，方差齊性時(shí)，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的 50% MWT 和p38及p-p38相對蛋白濃度比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的 Friedman ANOVA 方差分析，p-p38的 IOD 值的組間比較采用 One-way ANOVA 方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)用 LSD法兩兩比較；方差不齊時(shí)，50% MWT 和p-p38相對蛋白濃度比較采用多因素方差分析，兩兩比較用 Dunnett' s T3 法，p-p38的 IOD 值組間比較采用 Kruskal-Walllis 秩和檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.建模前后各組大鼠機(jī)械痛敏閾值的變化

各組大鼠術(shù)前的50% MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Blank組相比，Sham組大鼠的50%MWT在術(shù)后第1天稍有下降 (P ＜ 0.05), 隨后逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平；NP組在術(shù)后第1天即出現(xiàn)50%MWT下降，術(shù)后第3天下降更為明顯，持續(xù)至術(shù)后第 28 天 (P ＜ 0.05，見圖 1)。

2.小膠質(zhì)細(xì)胞激活含量變化

與Blank組和Sham組比較，NP組術(shù)后1天、3天及7天脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞激活，第1天即出現(xiàn)IOD值上升，第3天升高達(dá)峰值 (P ＜ 0.05)，至第14天和28天顯著降低(P ＜ 0.05，見圖2、3)。

3.星形膠質(zhì)細(xì)胞激活含量變化

與Blank組和Sham組比較，NP組術(shù)后7 d、14 d、28 d脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，且術(shù)后第7天開始出現(xiàn)IOD值升高，第14天上升達(dá)峰值，持續(xù)至術(shù)后第28天(P ＜ 0.05，見圖4、5)。

4. p-p38表達(dá)及含量變化

與Blank組和Sham組比較，NP組術(shù)后1天、3天及7天脊髓背角p-p38表達(dá)，且術(shù)后第1天即開始出現(xiàn)IOD值升高，第3天上升達(dá)峰值(P ＜ 0.05)，術(shù)后第14天和28天顯著降低(P ＜ 0.05，見圖6、7)。

5. p-p38蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位

模型組大鼠術(shù)后第7 d脊髓背角內(nèi)p-p38、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元表達(dá)陽性，免疫熒光雙標(biāo)顯示p-p38主要表達(dá)于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，少量表達(dá)于神經(jīng)元，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)無p-p38表達(dá)（見圖8）。

6. 給予p38 MAPK抑制劑SB203580后大鼠機(jī)械痛敏閾值的變化

圖1 手術(shù)前后各組大鼠術(shù)側(cè)后足50% MWT的比較*P ＜ 0.05，與 Blank組相比，#P ＜ 0.05，與術(shù)前50% MWT值相比Fig.1 The comparison of preoperative and postoperative 50% MWT of different groups of rats*P ＜ 0.05，compared with group Blank; #P ＜ 0.05，compared with 50% MWT before surgery.

圖2 各組大鼠脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的比較A-E分別為模型組術(shù)后1、3、7、14、28天脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光表達(dá)結(jié)果；F，G分別為假手術(shù)組與空白組術(shù)后第7天脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光表達(dá)結(jié)果，Scale bar = 200 μmFig. 2 The activation of microglia in the spinal dorsal horn of different group of rats.A-E: reveal the immuno fl uorescence of microglial marker OX-42 in the spinal cord on postoperative day 1, 3, 7, 14 and 28 in Group NP, respectively; F, G: show the immuno fl uorescence of microglial marker OX-42 in the spinal cord on postoperative day 7 in Group Sham and Blank, respectively. Scale bar = 200 μm.

圖3 各組大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞積分光密度值的比較 (n = 6,±SD)*P ＜ 0. 05，與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05，NP 組內(nèi)與術(shù)后3天相比Fig.3 Integrated optical density value of OX-42 in spinal dorsal horn of different group of rats (n = 6,±SD)*P ＜ 0.05, compared with group Sham; #P ＜ 0.05,compared with 3 days after surgery in group NP.

圖4 各組大鼠脊髓背角中星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的比較H-L分別為模型組術(shù)后1、3、7、14、28天大鼠脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光表達(dá)結(jié)果；M，N分別為假手術(shù)組與空白組術(shù)后第7天大鼠脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光表達(dá)結(jié)果，Scale bar = 200 μmFig. 4 The activation of astrocytes in the spinal dorsal horn of different group of rats H-L: The immuno fl uorescence of astrocyte marker GFAP in the spinal cord on postoperative day 1, 3, 7, 14 and 28 in Group NP, respectively；M, N: The immuno fl uorescence of astrocyte marker GFAP in the spinal cord on postoperative day 7 in Group Sham and Blank, respectively. Scale bar = 200 μm.

圖5 各組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞積分光密度值的比較(n = 6,±SD)*P ＜ 0. 05，與 Sham 組相比，#P ＜ 0.05，NP 組內(nèi)與術(shù)后14天相比Fig.5 Integrated optical density value of GFAP in spinal dorsal horn of different group of rats (n = 6,±SD)*P ＜ 0. 05, compared with group Sham; #P ＜ 0.05,compared with 14 days after surgery in group NP.

圖6 各組大鼠脊髓背角中p-p38表達(dá)的比較O-S分別為模型組術(shù)后1、3、7、14、28天大鼠脊髓背角內(nèi)p-p38免疫熒光表達(dá)結(jié)果；T與U分別為假手術(shù)組與空白組術(shù)后第7天大鼠脊髓背角內(nèi)p-p38免疫熒光表達(dá)結(jié)果，Scale bar = 200 μmFig. 6 The expression of p-p38 in the spinal dorsal horn of different group of rats O-S: reveal the immuno fl uorescence of p-p38 in the spinal cord on postoperative day 1, 3, 7, 14 and 28 in Group NP,respectively; T, U show the immuno fl uorescence of p-p38 in the spinal cord on postoperative day 7 in Group Sham and Blank, respectively. Scale bar = 200 μm.

圖7 各組大鼠脊髓背角p-p38積分光密度值的比較(n = 6,±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham 組相比，#P ＜ 0.05，NP 組內(nèi)與術(shù)后3天相比Fig.7 Integrated optical density value of p-p38 in spinal dorsal horn of different group of rats (n = 6,±SD)*P ＜ 0.05, compared with Group Sham；#P ＜ 0.05,compared with 3 days after surgery in group NP.

與Blank組比較，NP組，Sham組，DMSO組和SB組大鼠術(shù)后第1天痛閾均下降(P ＜ 0.05)；與Sham組相比較，術(shù)后第2天給藥前，NP組、DMSO組和SB組的50% MWT均下降(P ＜ 0.05)。在給藥后3 h、5 h、7 h及12 h，SB 組大鼠的50%MWT較給藥前升高(P ＜ 0.05)，與相同時(shí)間點(diǎn)NP組和DMSO組比較，SB組大鼠的50% MWT升高(P ＜ 0.05)，在給藥后3 h達(dá)峰值，而藥后24 h恢復(fù)到給藥前水平；與給藥前相比，DMSO組在給藥后各時(shí)間點(diǎn)50% MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥前后各時(shí)間點(diǎn)，NP組和DMSO組50% MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖9）。

7. p38及p-p38蛋白表達(dá)結(jié)果及變化

硬膜外給藥后各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出L4～6脊髓背角提取總蛋白后檢測p 38蛋白相對濃度，各標(biāo)本均使用β-actin作為內(nèi)參蛋白，定為1。免疫印記條帶顯示，給藥后各組大鼠脊髓背角p38蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與Sham組相比較，NP組，DMSO組和SB組p-p38蛋白表達(dá)均升高(P ＜ 0.05)；與相同時(shí)間點(diǎn)NP組和DMSO組比較，SB組p-p38蛋白濃度在給藥后3 h，7 h，12 h下降，其中3 h下降最為明顯(P ＜ 0.05)。NP組與DMSO組比較，p-p38蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖10）。

討 論

圖8 免疫熒光雙標(biāo)檢測p-p38與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)情況I、IV、VII紅色區(qū)域?yàn)闉槟Ｐ徒M大鼠術(shù)后第7 d脊髓背角p-p38陽性表達(dá)；II，V，VIII綠色區(qū)域分別為小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元陽性表達(dá)；III為I，II融合后結(jié)果，顯示p-p38與小膠質(zhì)細(xì)胞大量共表達(dá)；VI為IV和V融合后結(jié)果，顯示p-p38與星型膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)陰性；IX為VII和VIII融合后結(jié)果，顯示p-p38與神經(jīng)元細(xì)胞少量共表達(dá)，圖中箭頭及方框內(nèi)所示黃色區(qū)域?yàn)楣脖磉_(dá)部位，Scale bar = 200 μmFig.8 The co-expression of p-p38 and glial cells by Immunohistochemical double-staining method In the fi gure, the red areas of I, IV, and VII are the immuno fl uorescence of p-p38 in the spinal cord on postoperative day 7; The green areas of II, V and VIII are the immuno fl uorescence of the markers for microglia, astrocyte and neuron in the spinal cord on postoperative day 7. Double-labeled immuno fl uorescence of p-p38, OX-42 (a microglia marker), glial fi brillary acidic protein(GFAP, an astrocyte marker), and neuronal speci fi c nuclear protein (NeuN, a neuronal marker) in the spinal dorsal horn were shown in III, VI and IX. III: Double-staining for p-p38 (red) and OX-42 (green) reveals a heavy co-localization (arrows, yellow);VI: Double-labeling of p-p38 (red) with GFAP (green) showed no co-localization; IX: Double-staining demonstrates little co-localization (arrows, yellow) of p-p38 (red) and NeuN (green) in neurons of the spinal dorsal horn. Scale bar = 200 μm.

圖9 給藥前后各組大鼠術(shù)側(cè)后足50% MWT的比較(n = 6,±SD)*P ＜ 0.05，與Blank組比較; #P ＜ 0.05，與DMSO組相比；△P ＜ 0.05，與SB組給藥前相比Fig.9 The comparison of before and after administration 50% MWT of different groups of rats(n = 6,±SD)*P ＜ 0.05, compared with Group Blank; #P ＜ 0.05, compared with Group DMSO; △P ＜ 0.05, compared with before administration in group SB.

圖10 術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠脊髓背角 p38 反應(yīng)條帶和相對蛋白濃度A：Western Blot 實(shí)驗(yàn)獲得各組的p38和p-p38 蛋白條帶圖；B：不同時(shí)間點(diǎn)p38蛋白相對含量；C：不同時(shí)間點(diǎn)p-p38 蛋白相對含量，*P ＜ 0.05，與Sham組相比；#P ＜ 0.05，與NP組和DMSO組相比；△P ＜ 0.05，SB組與給藥后3 h相比Fig.10 The expression and relative concentration of p-p38 in different groups of rats at different time points after surgery A: p38 and p-p38 protein band diagram of each group detected by Western Blot. B: p38 protein relative content at each time point. C: p-p38 protein relative content at each time point, *P ＜ 0.05, compared with group Sham. #P ＜ 0.05,compared with group NP and DMSO; △P ＜ 0.05, compared with 3h after administration in group SB.

目前針對腰椎間盤突出癥主要有機(jī)械受壓、化學(xué)性神經(jīng)根炎和自身免疫學(xué)三種學(xué)說，神經(jīng)根炎性學(xué)說是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。突出髓核作為抗原可被免疫系統(tǒng)識別，激發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng)，從而容易導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)[5～7]。Takahashi 等發(fā)現(xiàn)突出的髓核組織內(nèi)含有炎癥因子如 TNF-a 等，對于髓核組織誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛至關(guān)重要[8]。許多研究在動(dòng)物模型中也己經(jīng)證實(shí)，突出的髓核組織接觸神經(jīng)根后能夠產(chǎn)生明顯的外周痛覺過敏[9,10]。本課題組早期構(gòu)建的動(dòng)物模型中，通過將大鼠自體尾髓轉(zhuǎn)移至L5背根神經(jīng)節(jié)，可誘發(fā)大鼠術(shù)后疼痛行為學(xué)發(fā)生改變，同時(shí)證明其背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)存在COX-2，NOS等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，說明自體髓核誘發(fā)了外周炎癥反應(yīng)[3]。

在脊髓水平，對疼痛的調(diào)制主要發(fā)生在脊髓背角。組織損傷引發(fā)感受器的極度活躍能引起脊髓傷害性感受器終端處神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的釋放增加，還能影響脊髓突觸的可塑性，同時(shí)持續(xù)的痛覺傳入也增強(qiáng)了脊髓背角突觸傳遞，最終導(dǎo)致了突觸后的脊髓背角神經(jīng)元的極度活躍，即中樞敏感化[11]。研究表明，由脊髓背角到大腦皮層的痛覺傳導(dǎo)通路間突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)介導(dǎo)了疼痛的中樞敏化[12]。膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要細(xì)胞組成成分，在正常生理?xiàng)l件下主要起支持細(xì)胞的作用，而膠質(zhì)細(xì)胞激活后與神經(jīng)元細(xì)胞之間發(fā)生緊密聯(lián)系，這一過程在不同類型的神經(jīng)退行性疾病以及脊髓背角疼痛易化過程中均發(fā)揮了重要作用[13]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，膠質(zhì)細(xì)胞主要包括小膠質(zhì)細(xì)胞，星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞三種[14]，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛和急性炎癥性疼痛中起重要作用，星型膠質(zhì)細(xì)胞在急性和慢性神經(jīng)元性疾病如癲癇，休克和缺血性疾病中發(fā)揮著積極效應(yīng)[15]，兩者均在脊髓水平參與了疼痛的中樞敏化機(jī)制。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓背角上存在如ERK等炎癥因子及相關(guān)通路的表達(dá)，而導(dǎo)致髓核致炎癥大鼠神經(jīng)根痛[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用大鼠自體髓核致炎模型，手術(shù)模型組機(jī)械痛閾值均在術(shù)后第1天開始降低，到第7天降至最低，可持續(xù)至術(shù)后28天，模型建立成功。我們通過取L4～6脊髓背角組織做免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯陽性。對不同天數(shù)的大鼠進(jìn)行取材，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)時(shí)間并不一致，在術(shù)后第3天，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而星型膠質(zhì)細(xì)胞在術(shù)后第7天出現(xiàn)激活，并持續(xù)至術(shù)后28天，我們推測可能是與小膠質(zhì)細(xì)胞參與炎癥的發(fā)生而星型膠質(zhì)細(xì)胞參與炎癥的發(fā)展和維持有關(guān)，在炎癥形成早期，主要誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而中晚期主要發(fā)生在星型膠質(zhì)細(xì)胞，可能是在炎癥的發(fā)生與發(fā)展中存在由急性轉(zhuǎn)為慢性的過程，或者由外周敏化轉(zhuǎn)向中樞敏化的過程。

絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)通路的激活在神經(jīng)可塑性誘導(dǎo)和維持上起到重要作用，如外周敏化和中樞敏化，因而加劇了傷害后所導(dǎo)致的痛覺過敏[17]。MAPK 有三個(gè)主要家族：ERKs、JNKs和p38 MAPKs，其中p38蛋白激酶在神經(jīng)損傷，脊髓損傷，炎癥，糖尿病，辣椒素和足底切開等多種疼痛模型的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[18]。在病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中，p38 MAPK匯集了多種激酶反應(yīng)通路，表明其可能在傷害性感受神經(jīng)元引起的可塑性改變中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果提示，在脊髓背角內(nèi)存在p38 MAPK激活和p-p38蛋白的表達(dá)，并且其表達(dá)和維持時(shí)間與小膠質(zhì)細(xì)胞相接近。免疫熒光雙標(biāo)顯示，p-p38與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX-42大量共表達(dá)，表明p-p38主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，這與Wen等[18]的研究相類似。為了進(jìn)一步驗(yàn)證p38 MAPK參與了髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛，我們在炎癥發(fā)生的早期（術(shù)后第2天）經(jīng)硬膜外導(dǎo)管給予p38 MAPK激酶的抑制劑SB203580，可短暫地降低（約12 h）傷害性機(jī)械刺激的痛敏反應(yīng)，其中在給藥后3 h出現(xiàn)明顯的痛閾值增高。研究證實(shí)MAPK的滅活是由一組雙特異性磷酸蛋白酶(MKPs)將蘇氨酸與酪氨酸去磷酸化作用恢復(fù)至基態(tài)水平導(dǎo)致，而SB203580能夠特異性地與該兩種非常相近的蛋白質(zhì)序列結(jié)合并抑制其活性，發(fā)揮對p38 MAPK通路的阻斷效應(yīng)[19]，這可能是本實(shí)驗(yàn)中SB203580改善大鼠機(jī)械性痛敏發(fā)揮抗炎效果的主要原因。由此，我們認(rèn)為p38 MAPK參與了誘發(fā)髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛。

本研究的不足之處在于我們只對小膠質(zhì)細(xì)胞與p38蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析，也僅僅說明兩者參與介導(dǎo)了髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛覺過敏，而對于p38基因如何在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們又是通過何種機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的，還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討。

綜上所述，脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞和p38 MAPK參與了髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛，p-p38 MAPK主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，在術(shù)后第2天給予p38 MAPK抑制劑可暫時(shí)緩解機(jī)械性痛覺過敏，為今后治療突出髓核誘發(fā)的神經(jīng)根炎性痛提供了理論依據(jù)。

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