夏威威 朱震奇 王凱豐 劉海鷹

(北京大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科，北京 100044)

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的一個(gè)重要特征，并且也被認(rèn)為是在脊髓痛覺傳導(dǎo)通路中導(dǎo)致疼痛敏化的一個(gè)重要機(jī)制[1,2]。脊髓部位突觸發(fā)生的LTP在中樞敏化(central sensitization)的誘導(dǎo)中起到了很重要的作用，中樞敏化被認(rèn)為是急性的術(shù)后疼痛和由一些由初始的疼痛事件引起的慢性疼痛（如外周的炎癥反應(yīng)或神經(jīng)病理改變）的一個(gè)重要原因[3]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但是仍然缺乏治療疼痛的有效方法。因此，更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和研究疼痛形成的可塑性機(jī)制，對(duì)于改善慢性疼痛的治療方案和防止疼痛慢性化具有重要意義。

有研究表明在動(dòng)物及動(dòng)物組織中，低頻(1或 2 Hz)[4]、中頻 (10 Hz)[4]和高頻 (100 Hz)[5～7]條件性電刺激(conditioning electrical stimulation,CES)刺激C纖維后，均能夠誘發(fā)其在脊髓背角淺層神經(jīng)突觸的LTP。在人體實(shí)驗(yàn)中，也可通過針形體表電極，應(yīng)用CES誘發(fā)類似LTP的痛覺增強(qiáng)，但刺激頻率最常用的為高頻電刺激(100 Hz)，而低頻電刺激會(huì)誘發(fā)類似長(zhǎng)時(shí)程抑制(Long-term depression, LTD)的痛覺減弱[8]。然而在大部分的神經(jīng)病理和炎癥狀態(tài)下，C纖維的痛覺感受器通常以1～10 Hz的低頻方式自然放電，而不是國(guó)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的高頻電刺激[9]。國(guó)內(nèi)對(duì)于應(yīng)用環(huán)形針形電極誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化也鮮有報(bào)道。另外不同的電刺激方式會(huì)可能會(huì)引起不同的神經(jīng)因子和炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而引起不同的炎癥反應(yīng)和誘發(fā)中樞敏化[10]。然而使神經(jīng)電刺激誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化的方式完全符合痛覺感受器不規(guī)律的自然放電過程是很困難的，而且難以實(shí)現(xiàn)其可重復(fù)性。

因此對(duì)于應(yīng)用體表針形電極，采用條件性電刺激在人體誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化的方案仍需要進(jìn)一步研究，以尋找到更為有效的電刺激頻率，使得電刺激頻率盡量接近于痛覺神經(jīng)末梢在疼痛狀態(tài)下的自然放電頻率，進(jìn)而建立更為合理和有效的長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化模型。本研究首次加入中頻(10 Hz)和更高頻(200 Hz)的條件性電刺激，目的是通過比較三種不同的電刺激頻率(10 Hz, 100 Hz 和200 Hz)，分析電刺激頻率對(duì)于誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化的作用，并分析所有測(cè)量參數(shù)之間的相關(guān)性。本研究的實(shí)驗(yàn)假設(shè)為由于10 Hz更加接近痛覺感受器在炎癥狀態(tài)下的自然放電頻率，因此可能會(huì)更加有效的誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化。

方 法

1. 受試者

20名健康受試者參加實(shí)驗(yàn)，其中10名男性，10名女性，年齡20～50歲，平均年齡28歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：受試者實(shí)驗(yàn)部位之前或者現(xiàn)在有皮膚疾病，患有神經(jīng)病理性疾病，患有慢性疼痛病史，濫用止痛藥物及酗酒者，患有正在發(fā)生疼痛的疾病。所有的受試者在參加實(shí)驗(yàn)之前均簽訂知情同意書。

2. 條件性電刺激

恒定電流刺激器(DS5; Digitimer Ltd; UK)產(chǎn)生的經(jīng)皮電刺激脈沖經(jīng)過環(huán)形的針刺電極到達(dá)刺激部位，刺激部位位于肘橫紋下方7 cm處，環(huán)形電極（直徑:10 mm）是由15個(gè)針形陰性電極構(gòu)成，每個(gè)陰性電極的直徑是0.2 mm，突出于圓形基底1 mm，陰極的周圍是環(huán)狀的陽(yáng)極，其內(nèi)徑是20 mm，外徑是40 mm（見圖1A）。這種電極被證實(shí)可以選擇性刺激A-δ纖維和C纖維，由于陰極的直徑非常小，可以在表皮層聚集大量電荷，而A-δ和C神經(jīng)纖維主要分布于表皮層[10]。

條件性電刺激的方案包括：①電刺激頻率為10 Hz，持續(xù)刺激50 s；②電刺激頻率為100 Hz，刺激1 s，間隔9 s，重復(fù)5次；③電刺激的頻率為200 Hz，刺激0.5 s，間隔9.5 s，重復(fù)5次。所有的條件性電刺激過程均持續(xù)50 s，共500 個(gè)方形電刺激脈沖，脈沖的波寬是1 ms。電刺激的強(qiáng)度是10倍的感覺閾值。感覺閾值的測(cè)量采用限制法，即一系列的電刺激脈沖會(huì)以上一個(gè)刺激脈沖強(qiáng)度的3%升高或降低電刺激強(qiáng)度，以受試者感覺到電刺激和電刺激感覺消失時(shí)記錄所測(cè)得的電刺激強(qiáng)度作為感覺閾值，重復(fù)此過程三遍，取其平均值作為最終的感覺閾值。

3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每位受試者在參加正式實(shí)驗(yàn)之前會(huì)進(jìn)行1次訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，以熟悉測(cè)量設(shè)備、疼痛感覺的分辨和評(píng)分問卷的使用。實(shí)驗(yàn)采用交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，所有受試者均接受4次實(shí)驗(yàn)，包括3次不同頻率條件性電刺激方案和一次無條件性電刺激空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（僅放置電極于右前臂），每次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間間隔至少一周。皮膚痛覺評(píng)分和炎癥反應(yīng)在實(shí)施CES之前記錄3次，在CES之后記錄6次，時(shí)間間隔是10 min（見圖1B）。皮膚痛覺的測(cè)定包括條件性電刺激部位對(duì)于單次電脈沖刺激的疼痛評(píng)分；電刺激周圍部位對(duì)于不同重量針刺刺激和輕觸刺激的痛覺評(píng)分。疼痛強(qiáng)度的評(píng)分采用視覺模擬評(píng)分法(visual analogue scale, VAS)，標(biāo)尺刻度為0～100，其中沒有任何感覺對(duì)應(yīng)刻度“0”，疼痛閾值對(duì)應(yīng)刻度“30”，能想象到的最疼的程度對(duì)應(yīng)刻度“100”。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) A. 實(shí)驗(yàn)裝置：環(huán)形針刺電極放置在右側(cè)前臂距離肘橫紋遠(yuǎn)側(cè)端7cm處，針刺覺刺激器(30 g和50 g)位于距離環(huán)形陰極15～20 mm的環(huán)形區(qū)域內(nèi)(異位)，輕觸覺的測(cè)量位于上下左右距離環(huán)形陰極15～20 mm的范圍內(nèi)（異位）。單次脈沖電刺激通過同一電極測(cè)量條件性電刺激部位的痛覺（同位）。B. 時(shí)間線：參數(shù)的測(cè)量包括皮膚炎癥反應(yīng)和痛覺的測(cè)量，所有的測(cè)量參數(shù)在條件性電刺激之前測(cè)量3次，之后測(cè)量6次，時(shí)間間隔10分鐘。Fig.1 Study design A. Experiment set up. The pin electrodes were placed on the right forearm 7 cm distal to the cubital fossa. Pinprick stimulators (30 g, 50 g) were placed in an around area 15～20 mm to the cathodes(heterotopic). Light touch stimuli were done 15～20 mm to the cathodes in four directions (up, down, left,right)(heterotopic). The single electrical stimulation was applied using the same electrode (homotopic). B.Time line. The measurements included in fl ammation responses and pain ratings. All measurements were repeated three times before and six times after the CES with 10 min intervals.

4. 炎癥性反應(yīng)

條件性電刺激后局部皮膚的炎癥反應(yīng)包括皮膚血流及溫度的變化。皮膚血流采用激光灌注成像儀(Full-Field Laser Perfusion Imager) (MoorFLPI; Moor Instruments Ltd, UK) 來評(píng)價(jià)電刺激后皮膚血流的變化情況。應(yīng)用紅外線成像儀 (Thermovision A40;FLIR; Sweden) 來測(cè)定電刺激后的皮膚溫度變化。二者的變化可一定程度上反應(yīng)外周組織在條件性電刺激之后的炎癥反應(yīng)變化。

5. 條件性電刺激部位的痛覺測(cè)定

在條件性電刺激部位進(jìn)行單個(gè)方形脈沖的電刺激，其刺激強(qiáng)度是10倍的電刺激感覺閾值，電刺激脈沖的波寬是1 ms。受試者在接受刺激后對(duì)其進(jìn)行VAS疼痛評(píng)分。此過程重復(fù)3次，取其平均值作為最終的痛覺評(píng)分（見圖1A）。

6. 條件性電刺激部位周圍的痛覺測(cè)定

在條件性電刺激部位的周圍距離陰性電極15～20 mm的環(huán)形皮膚區(qū)域內(nèi)測(cè)定針刺覺，針刺刺激器采用30 g和50 g（圓形尖端，直徑0.2 mm）。受試者分別對(duì)30 g和50 g針刺刺激進(jìn)行VAS痛覺評(píng)分（見圖1A）。輕觸覺的測(cè)定采用塑料桿醫(yī)用棉簽，在距離陰極上下左右四個(gè)方向15～20 mm的皮膚區(qū)域內(nèi)，由外向內(nèi)滑動(dòng)棉簽，棉簽桿部略彎曲，滑動(dòng)速度為1～2 cm/s。輕觸刺激進(jìn)行同上的VAS疼痛評(píng)分，結(jié)果取4次對(duì)輕觸滑動(dòng)刺激痛覺評(píng)分的平均值（見圖1A）。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用雙因素（電刺激頻率和時(shí)間）的重復(fù)測(cè)量的方差分析對(duì)條件性電刺激后的皮膚血流和溫度，異位的針刺感和輕觸感，同位的單脈沖電刺激疼痛評(píng)分進(jìn)行對(duì)比分析，電刺激頻率因素和時(shí)間因素均為組內(nèi)因素。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即條件性電刺激后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)占刺激前的百分比。采用Greenhouse-Geisser糾正球形檢驗(yàn)不通過。采用Bonferroni-Holm方法對(duì)多重比較進(jìn)行校正。采用Pearson相關(guān)性分析法分析不同條件性電刺激后的測(cè)量參數(shù)間的相關(guān)性。結(jié)果表達(dá)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)。P ＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 基線資料

測(cè)量后的條件性電刺激和同位的單個(gè)脈沖的電刺激強(qiáng)度是2.95±1.5 mA（感覺閾值×10；均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n = 80），此電刺激強(qiáng)度高于90%的受試者（18/20）的疼痛閾值（30/100）。30 g針刺刺激器的平均疼痛評(píng)分為21±11（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n = 80），其刺激強(qiáng)度高于55%的受試者（11/20）的疼痛閾值(30/100)。50 g針刺感刺激器的平均疼痛評(píng)分為27±15（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n = 80），其刺激強(qiáng)度高于90%的受試者（18/20）的疼痛閾值(30/100)。棉簽滑動(dòng)的平均痛覺評(píng)分為6.8±4.3（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n = 80），其刺激強(qiáng)度均低于受試者的疼痛閾值(30/100)。在條件性電刺激之前，各測(cè)量參數(shù)的基線資料各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在條件性電刺激之后，所有受試者均未出現(xiàn)肉眼可見的皮膚損害。

2. 皮膚炎癥反應(yīng)的比較

在皮膚血流的測(cè)量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)在條件性電刺激頻率和電刺激后的觀察時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（重復(fù)測(cè)量的方差分析：F = 4.141, P ＜ 0.05）: 在10 Hz和200 Hz電刺激后10 min，皮膚血流高于對(duì)照期(t = 4.2, P = 0.001; t = 3.57, P = 0.003)；在 10 Hz電刺激后，10 min的皮膚血流量高于之后的任何時(shí)間點(diǎn)(P ＜ 0.05)，20 min的皮膚血流量高于60 min的血流量（t = 4.881, P = 0.004）；在200 Hz電刺激后，10 min的皮膚血流量高于之后的任何時(shí)間點(diǎn)(P ＜ 0.05)。在皮膚溫度的測(cè)量中，我們發(fā)現(xiàn)測(cè)量部位的皮膚溫度各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，溫度也沒有隨時(shí)間變化而變化，電刺激頻率和觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)之間也沒有發(fā)現(xiàn)交互效應(yīng)。

3 條件性電刺激部位周圍（異位）疼痛程度的比較

條件性電刺激部位周圍的針刺感覺相比于對(duì)照期，在電刺激后疼痛程度均升高（重復(fù)測(cè)量的方差分析:條件性電刺激效應(yīng); 30 g: F = 13.94, P ＜ 0.01;50g: F = 10.19, P ＜ 0.01），但是三種不同頻率的條件性電刺激期之間并沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。30 g針刺疼痛值在條件性電刺激后逐漸升高（時(shí)間效應(yīng)，F(xiàn) = 5.8, P = 0.002），升高到30 min后達(dá)到平臺(tái)期（見圖3A）。50 g針刺疼痛值在電刺激后高于對(duì)照期，并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（時(shí)間效應(yīng)，F(xiàn) = 11.88, P ＜ 0.01）（見圖3B）。條件性電刺激部位周圍的輕觸覺的感覺評(píng)分在電刺激后高于對(duì)照期（條件性電刺激效應(yīng)，F(xiàn) = 10.51, P ＜ 0.05），并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，但未發(fā)現(xiàn)輕觸覺的疼痛評(píng)分隨時(shí)間而變化，三種不同頻率的條件性電刺激期之間并沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（見圖3C）。

4. 條件性電刺激部位（同位）疼痛程度的比較

條件性電刺激部位對(duì)于單個(gè)脈沖電刺激的疼痛評(píng)分在各組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(重復(fù)測(cè)量的方差分析：F = 2.238, P = 0.114)。時(shí)間主效應(yīng)發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 7.0, P = 0.001）:在條件性電刺激后10 min的疼痛評(píng)分低于在30 min (P = 0.034)、40 min (P = 0.049)、50 min (P = 0.022)和 60 min(P = 0.009)的疼痛評(píng)分（見圖3D）。在條件性電刺激頻率和時(shí)間之間未發(fā)現(xiàn)有交互效應(yīng)（F = 1.406,P = 0.227）。

5. 測(cè)量參數(shù)的相關(guān)性分析

圖2 炎癥反應(yīng)(A)皮膚血流：皮膚血流在10 Hz和200 Hz條件性電刺激后均高于對(duì)照期，后逐漸下降。(B)皮膚溫度：皮膚溫度在各實(shí)驗(yàn)期之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，各時(shí)間點(diǎn)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。Fig.2 In fl ammation responses(A) Super fi cial blood fl ow (SBF). SBF was found to be higher than the control session after 10 Hz and 200 Hz CES, then gradually declined. (B) Skin temperature (ST). ST was not found to be signi fi cantly different between sessions and between each time point.

圖3 疼痛評(píng)分(A, B)針刺覺（30 g, 50 g）：針刺覺疼痛評(píng)分在三種CES后均高于對(duì)照期，并持續(xù)升高至觀察結(jié)束。(C)輕觸覺：輕觸覺疼痛評(píng)分在三種CES后均高于對(duì)照期，并持續(xù)升高至觀察結(jié)束。(D)單次脈沖電刺激：疼痛評(píng)分在CES呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但在各實(shí)驗(yàn)期之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Fig.3 (A, B) Pinprick sensation (30 g, 50 g). After CES, The pinprick pain ratings were higher than the control session and increased until the end of observation. (C) Light touch sensation. The light touch pain ratings were higher than the control session after CES and increased until the end of observation. (D) Single electrical stimulation (SES). The pain ratings to SES increased in the post-CES period, but no signi fi cant differences were found between sessions.

對(duì)條件性電刺激后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)在各實(shí)驗(yàn)期（10 Hz, 100 Hz,200 Hz和對(duì)照）中，皮膚血流與皮膚溫度的變化之間存在一定的相關(guān)性，二者的變化趨勢(shì)是相似的（見圖4）。皮膚血流和溫度的變化與異位針刺痛覺（30 g和50 g）的變化沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（見表1）。皮膚血流和溫度的變化與異位輕觸覺的變化在電刺激期未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，在對(duì)照期發(fā)現(xiàn)弱相關(guān)性（見表1）。同位的單次脈沖電刺激痛覺變化與皮膚血流和溫度的變化之間在各條件性電刺激期未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，在對(duì)照期與溫度變化之間發(fā)現(xiàn)弱相關(guān)性（見表1）。同位的單次脈沖電刺激痛覺變化與異位針刺痛覺（30 g和50 g）的變化在各實(shí)驗(yàn)期存在一定的相關(guān)性，二者的變化趨勢(shì)是相似的（見圖5）。同位的單次脈沖電刺激痛覺變化與異位輕觸覺的變化在10 Hz和100 Hz實(shí)驗(yàn)期存在弱相關(guān)性。異位的針刺覺之間（30 g和50 g）在各實(shí)驗(yàn)期也發(fā)現(xiàn)具有一定的相關(guān)性。異位的輕觸覺變化與針刺覺變化之間，在10 Hz、100 Hz和對(duì)照期中，發(fā)現(xiàn)具有一定的相關(guān)性（見表1）。

討 論

圖4 皮膚溫度與血流之間的相關(guān)性。對(duì)照期(A)、10 Hz (B)、100 Hz (C)和200 Hz (D)實(shí)驗(yàn)期皮膚溫度與血流之間的相關(guān)性。r: Pearson相關(guān)系數(shù)Fig.4 Correlations between skin temperature (ST) and superficial blood flow (SBF). Correlations between ST and SBF are shown in the control session (A), 10 Hz session (B), 100 Hz session (C) and 200 Hz session (D). r, Pearson' s correlation coef fi cient.

應(yīng)用體表針形電極，通過條件性電刺激誘發(fā)類似中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞LTP的長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化，其中一個(gè)關(guān)鍵因素就是選擇合適的電刺激頻率，以更有效的激動(dòng)傷害性感受器。在神經(jīng)病理性或炎癥性疼痛狀態(tài)下，C-纖維傷害性感受器持續(xù)的低頻放電（1～10 Hz）誘發(fā)了痛覺過敏[11,12]。200 Hz已超過傷害性感受器的最大放電頻率[13]，因此可能會(huì)存在脈沖的傳導(dǎo)失敗，即有些刺激脈沖沒能通過突觸傳遞到達(dá)神經(jīng)中樞。低頻的電刺激（如1 Hz）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也可以誘導(dǎo)脊髓突觸的LTP，但應(yīng)用到人體實(shí)驗(yàn)中，所誘導(dǎo)的卻是類似長(zhǎng)時(shí)程抑制（Longterm depression, LTD）的痛覺減弱[4,8]，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)LTP的電刺激頻率范圍并非完全能夠適用到人體的實(shí)驗(yàn)中，表明疼痛的變化并非是簡(jiǎn)單的單個(gè)神經(jīng)突觸的變化，可能是包括脊髓腦的上行和下行神經(jīng)傳導(dǎo)通路及其他神經(jīng)調(diào)控機(jī)制綜合作用的結(jié)果。以激活C-纖維的刺激強(qiáng)度刺激感覺神經(jīng)纖維能夠引起神經(jīng)纖維中樞端釋放谷氨酸，谷氨酸可以激活其N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，這對(duì)于誘發(fā)LTP是非常重要的[1,14]。另外動(dòng)物傷害性感受(Nociception)敏化的一個(gè)重要機(jī)制是在神經(jīng)肽能C纖維和脊髓板層I (Lamina I) 有P物質(zhì)(Substance P,SP)受體的神經(jīng)元形成突觸的部位發(fā)生LTP，這可能也是人類痛覺敏化的重要機(jī)制之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)100 Hz和30 Hz的電刺激方式可同時(shí)引起SP和谷氨酸的釋放，而持續(xù)低頻(1 Hz)只能引起SP的釋放，另外有發(fā)現(xiàn)間斷高頻電刺激(100 Hz)可以引起腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放[10]。但對(duì)于應(yīng)用200 Hz CES促進(jìn)何種神經(jīng)及炎性分子的釋放目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此不同頻率CES誘導(dǎo)痛覺敏化的過程可能涉及到了不同神經(jīng)及炎性分子的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn)，三種不同頻率CES刺激的皮膚部位的血流量增加，這是由于肽能傷害性感受器在受到刺激后發(fā)生軸突反射(Axon re fl ex)的結(jié)果，但我們發(fā)現(xiàn)三種頻率電刺激對(duì)于皮膚血流量的影響是不一樣的，這可能因?yàn)椴煌l率的電刺激對(duì)于肽能神經(jīng)纖維的激動(dòng)程度是不一樣的，導(dǎo)致神經(jīng)末梢不同程度地釋放擴(kuò)血管物質(zhì)，其中激動(dòng)的肽能神經(jīng)纖維主要是C-纖維，能夠分泌神經(jīng)肽能物質(zhì)，如SP和鈣離子基因相關(guān)蛋白[15,16]。與100 Hz和200 Hz CES相比，10 Hz CES引起的皮膚血流量更高，持續(xù)時(shí)間也相對(duì)更長(zhǎng)，這與Dusch的研究發(fā)現(xiàn)相一致，低頻電刺激可以引起更大的炎癥紅斑 (Red fl are) 反應(yīng)，這與機(jī)械刺激不敏感的C-纖維也被低頻刺激激活有關(guān)[17]。并且有研究發(fā)現(xiàn)C纖維更容易傾向于被低頻刺激激活，并在低頻刺激下傳導(dǎo)信號(hào)，其反應(yīng)的時(shí)間也隨刺激頻率的增高而延長(zhǎng)，因此相比于高頻電刺激，10 Hz電刺激可能更能夠有效的激活C-纖維傷害性感受器[18]。電刺激后的皮膚溫度和對(duì)照期并沒有區(qū)別，顯示出皮膚溫度并非評(píng)價(jià)電刺激后皮膚神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)。但本研究發(fā)現(xiàn)皮膚血流和溫度之間發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)性，二者的變化趨勢(shì)是相似的，可能由于紅外線成像所測(cè)的肢體溫度受深部組織溫度的影響比較大，進(jìn)而無法準(zhǔn)確的獲取局部皮膚淺層的溫度值。皮膚血流與同位（單次脈沖電刺激）及異位（針刺覺和輕觸覺）的皮膚感覺變化沒有相關(guān)性，表明外周神經(jīng)末梢炎性導(dǎo)致的血流發(fā)展過程與痛覺改變的變化趨勢(shì)是不同的，而引起血流變化的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表1 測(cè)量參數(shù)的相關(guān)性分析（r值，t值）Table 1 Correlations among measured parameters (r value, t value)

重復(fù)的刺激痛覺C-纖維會(huì)引起傳導(dǎo)痛覺的突觸傳遞效能增強(qiáng)，此過程也會(huì)導(dǎo)致傳導(dǎo)非痛覺的A-β纖維和傳導(dǎo)痛覺的A-δ纖維傳導(dǎo)通路的易化，并因此分別產(chǎn)生了機(jī)械刺激的痛覺過敏 (Hyperalgesia)和痛覺超敏(Allodynia)[7]。有報(bào)道稱TRPV1-陽(yáng)性C-纖維和TRPV1-陽(yáng)性A-纖維導(dǎo)致了異位的長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化，但前者起主要作用；而TRPV1-陰性A-纖維主要參與介導(dǎo)繼發(fā)性(Secondary)針刺痛覺過敏[19]。在本研究中，條件性電刺激周圍部位的針刺痛覺和輕觸覺在CES后升高，其原因可歸結(jié)于異位的A-δ神經(jīng)傳導(dǎo)通路的易化，其中可能涉及到幾項(xiàng)機(jī)制：①被易化的A-纖維傳導(dǎo)通路與條件性C-纖維傳導(dǎo)通路在脊髓同一神經(jīng)元的匯聚是此現(xiàn)象能夠發(fā)生的解剖學(xué)基礎(chǔ)；②同時(shí)激動(dòng)了谷氨酸能中間神經(jīng)元，其導(dǎo)致了脊髓中痛覺傳遞神經(jīng)元的敏化，另外起源于腦干的延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核的血清素能下行傳導(dǎo)通路的易化可維持神經(jīng)中樞的敏化[20]；③CES刺激部位及其周圍的機(jī)械刺激非敏感“靜默”痛覺感受器("Silent" nociceptor)也可能被條件性電刺激所激活[21]。外周神經(jīng)的敏化也被認(rèn)為是導(dǎo)致次級(jí)機(jī)械刺激敏化的一個(gè)重要原因，導(dǎo)致痛覺敏化的外周機(jī)制中一個(gè)重要的表現(xiàn)是神經(jīng)源性的血管擴(kuò)張，其中涉及一些神經(jīng)肽能物質(zhì)的釋放[22,23]。這些神經(jīng)肽能物質(zhì)可以擴(kuò)散到其它突觸的受體，并興奮臨近神經(jīng)元的機(jī)械刺激傳導(dǎo)通路[15]。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚血流與異位的針刺覺和輕觸覺不存在相關(guān)性，說明外周機(jī)制可能并沒有參與到異位長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化的形成中，而且本實(shí)驗(yàn)中異位的機(jī)械刺激位置在很大程度上是位于皮膚血流變化范圍之外的，以避免皮膚血流升高對(duì)于測(cè)量異位痛覺的影響，因此，異位痛覺敏化的主要原因考慮主要和神經(jīng)中樞的敏化改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)異位與同位的痛覺敏化存在一定相關(guān)性，提示二者的變化趨勢(shì)是相似的，說明痛覺敏化的外周機(jī)制和中樞機(jī)制之間可能存在一定的協(xié)同關(guān)系。異位針刺覺和輕觸覺之間在10 Hz和100 Hz存在一定相關(guān)性，提示A-δ和A-β纖維傳導(dǎo)通路存在相似的易化趨勢(shì)。

圖5 針刺痛覺與單脈沖電刺激痛覺評(píng)分之間的相關(guān)性。對(duì)照期(A)、10 Hz (B)、100 Hz (C)和200 Hz (D)實(shí)驗(yàn)期針刺痛覺與單脈沖電刺激痛覺評(píng)分之間的相關(guān)性。r: Pearson相關(guān)系數(shù)。Fig.5 Correlations between pain ratings to pinprick stimuli and single electrical stimulation (SES). Correlations between pinprick stimuli and SES are shown in the control session (A), 10 Hz session (B), 100 Hz session (C) and 200 Hz session (D).r, Pearson' s correlation coef fi cient.

TRPV1-陽(yáng)性C-纖維痛覺感受器在誘導(dǎo)同位長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化中占主要地位，TRPV1-陰性C-纖維也同樣會(huì)發(fā)生同位的自我易化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)同位疼痛評(píng)分相比于對(duì)照期并沒有升高，這與Klein的研究結(jié)果不同，他們研究發(fā)現(xiàn)，同位疼痛評(píng)分在CES之后高于對(duì)照組[7]，原因可能為：在于Klein的實(shí)驗(yàn)中，疼痛評(píng)分的測(cè)量間隔時(shí)間是2 min，而本實(shí)驗(yàn)的測(cè)量間隔時(shí)間是10 min，因此較長(zhǎng)的時(shí)間間隔可能會(huì)遺漏疼痛隨時(shí)間的變化。另外，van den Broeke在研究中發(fā)現(xiàn)，高頻電刺激后，同位疼痛評(píng)分是降低的，盡管腦電記錄的事件相關(guān)電位是增強(qiáng)的[24]。外周神經(jīng)敏感化(Peripheral sensitization)是原發(fā)性(Primary)痛覺過敏的一個(gè)重要原因[1]，但在本研究中，皮膚血流的變化與單脈沖電刺激的疼痛評(píng)分之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)同位長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化可能是由于：①LTP和LTD之間的拮抗作用，有研究表明在刺激A-δ纖維后出現(xiàn)痛覺的長(zhǎng)時(shí)程抑制而不是敏化，因此條件性電刺激可能同時(shí)激動(dòng)了C-纖維和A-δ纖維，進(jìn)而發(fā)生了某種潛在的相互拮抗作用[2]；②另外由于在同一位置進(jìn)行了大量重復(fù)的電刺激后，感受器產(chǎn)生了適應(yīng)或者疲勞[25]；③在本研究中，由于需要重復(fù)測(cè)量炎癥反應(yīng)及皮膚感覺，刺激電極在前臂的位置需要每10 min移走和復(fù)位一次，因此可能導(dǎo)致測(cè)量皮膚感覺的位置存在一定程度的偏差，從而可能掩蓋了同位長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化的存在。

本研究發(fā)現(xiàn)10 Hz和200 Hz的電刺激方案同樣可以引起異位的長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化；電刺激引起的皮膚血流的變化與異位針刺覺、輕觸覺和同位的痛覺變化不存在相關(guān)性，但同位的痛覺變化和異位的痛覺變化存在一定相關(guān)性，異位針刺覺變化和輕觸覺變化之間存在一定相關(guān)性。條件性電刺激誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化反映出痛覺傳導(dǎo)通路的神經(jīng)可塑性。由于10 Hz電刺激頻率更接近于炎癥和神經(jīng)病理性疼痛的痛覺神經(jīng)末梢的放電頻率，所以此長(zhǎng)時(shí)程痛覺敏化模型可被建議應(yīng)用到相關(guān)的疼痛研究中。

[1]Sandkühler J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. 2009/04/04Physiol Rev, 2009, 89(2):707 ～ 758.

[2]Pfau DB, Klein T, Putzer D, et al. Analysis of hyperalgesia time courses in humans after painful electrical high-frequency stimulation identi fi es a possible transition from early to late LTP-like pain plasticity.Pain, International Association for the Study of Pain,2011, 152(7): 1532 ～ 1539.

[3]鞏克瑞,李菁錦. 神經(jīng)病理性疼痛與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng). 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2005, 11(12): 994 ～ 995.

[4]Kim HY, Jun J, Wang J, et al. Induction of long-term potentiation and long-term depression is cell-type speci fi c in the spinal cord. Pain, 2015, 156(4): 618 ～ 625.

[5]Liu X, Sandkühler J. Characterization of long-term potentiation of C- fi ber-evoked potentials in spinal dorsal horn of adult rat: essential role of NK1 and NK2 receptors.Journal of neurophysiology, 1997, 78(4): 1973 ～ 1982.

[6]謝長(zhǎng)春,高崇榮,盧振和,等. 不同頻率脈沖射頻對(duì)大鼠脊髓背角C-纖維誘發(fā)電位長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響.中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 12(6): 325 ～ 328.

[7]邢國(guó)剛,劉風(fēng)雨,姚磊,等. 神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程可塑性變化. 北京大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版 ), 2003, 35(3): 226 ～ 230.

[8]Klein T, Magerl W, Hopf HC, et al. Perceptual correlates of nociceptive long-term potentiation and long-term depression in humans. 2004/01/30J Neurosci,2004, 24(4): 964 ～ 971.

[9]Ji R-R, Kohno T, Moore K a, et al. Central sensitization and LTP: do pain and memory share similar mechanisms.Trends in Neurosciences, 2003, 26(12): 696 ～ 705.

[10]Lever IJ, Bradbury EJ, Cunningham JR, et al. Brainderived neurotrophic factor is released in the dorsal horn by distinctive patterns of afferent fi ber stimulation.2001, 21(12): 4469 ～ 4477.

[11]Biurrun Manresa Ja, M?rch CD, Andersen OK. Long-term facilitation of nociceptive withdrawal reflexes following low-frequency conditioning electrical stimulation: a new model for central sensitization in humans. European journal of pain (London, England), 2010, 14(8): 822 ～ 831.

[12]Han HC, Lee DH, Chung JM. Characteristics of ectopic discharges in a rat neuropathic pain model. Pain, 2000,84(2–3): 253 ～ 261.

[13]Xiao WH, Bennett GJ. Persistent low-frequency spontaneous discharge in A-fiber and C-fiber primary afferent neurons during an in fl ammatory pain condition.Anesthesiology, 2007, 107(5): 813 ～ 821.

[14]Weidner C, Schmelz M, Schmidt R, et al. Neural signal processing: the underestimated contribution of peripheral human C- fi bers. The Journal of neuroscience: the of fi cial journal of the Society for Neuroscience, 2002, 22(15): 6704 ～ 6712.

[15]Liu H, Brown JL, Jasmin L, et al. Synaptic relationship between substance P and the substance P receptor:light and electron microscopic characterization of the mismatch between neuropeptides and their receptors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(3): 1009 ～ 1013.

[16]Brain SD, Williams TJ. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide.Nature, 1988, 335: 73 ～ 75.

[17]Dusch M, Schley M, Rukwied R, et al. Rapid flare development evoked by current frequency-dependent stimulation analyzed by full-field laser perfusion imaging. Neuroreport, 2007, 18(11): 1101 ～ 1105.

[18]Raymond SA, Thalhammer JG, Popitz-Bergez F, et al.Changes in axonal impulse conduction correlate with sensory modality in primary afferent fibers in the rat.Brain research, 1990, 526(2): 318 ～ 321.

[19]Henrich F, Magerl W, Klein T, et al. Capsaicinsensitive C- and A- fi bre nociceptors control long-term potentiation-like pain ampli fi cation in humans. Brain :a journal of neurology, 2015, 138(Pt 9): 2505 ～ 2520.

[20]Santos S F A, Rebelo S, Derkach V A, et al. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of physiology,2007, 581(Pt 1): 241 ～ 254.

[21]Serra J, Bostock H, Solà R, et al. Microneurographic identi fi cation of spontaneous activity in C-nociceptors in neuropathic pain states in humans and rats. Pain,2012, 153(1): 42 ～ 55.

[22]Sumikura H, Andersen O K, Drewes A M, et al. Spatial and temporal profiles of flare and hyperalgesia after intradermal capsaicin. Pain, 2003, 105(1–2): 285 ～ 291.

[23]Lewis T. The blood vessels of the human skin and their response. Shaw, London: 1927.

[24]Van den Broeke EN, Van Heck CH, Ceelen LAJM, et al. The effect of high-frequency conditioning stimulation of human skin on reported pain intensity and event-related potentials.Journal of neurophysiology, 2012, 108(8): 2276 ～ 2281.

[25]De Col R, Maih?fner C. Centrally mediated sensory decline induced by differential C-fiber stimulation.Pain, 2008, 138(3): 556 ～ 564.