劉啟順，陳 瑋，左 楊, ，吳樹麗, ，譚海東，曹旭鵬，張付云，尹 恒

( 1. 中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023 )

小球藻(Chorella)是一種球形或者橢球形普生性單細(xì)胞綠藻，細(xì)胞直徑2～12 μm，主要生長在土壤、潮濕的巖石表面及淡水中[1]。小球藻生態(tài)分布廣，生長速度快，易于培養(yǎng)，應(yīng)用價值高，小球藻對鹽度、溫度等變化適應(yīng)能力強，培養(yǎng)簡便，繁殖快，適合大規(guī)模養(yǎng)殖[2]。

小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、核酸、膳食纖維及葉綠素等，這些營養(yǎng)素是維持和促進(jìn)人體健康所不可缺少的[3]。小球藻在正常生長條件下，其細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量不低于50%，脂類的含量約為25%。在氮饑餓條件下，蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)生長時脂類含量最高可達(dá)86%，碳水化合物含量也近20%，葉綠素含量為4%～6%[4-5]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于小球藻中多糖的報道主要集中在對小球藻水溶性多糖的分離純化、糖鏈結(jié)構(gòu)分析以及生物活性等方面的研究[6-11]。鄧永智等[7]對小球藻多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用超聲波輔助乙酸溶液提取法提取效果最好，而且用pH由低到高的水溶液提取得到的多糖其單糖組成和單糖比例不盡相同，為小球藻多糖的提取和多糖結(jié)構(gòu)的分析提供了一定的參考方法。施英等[12]研究了蛋白核小球藻粗多糖的細(xì)胞免疫和巨噬細(xì)胞吞噬作用及其體液免疫的功能，發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻粗多糖對小鼠的免疫功能有顯著的調(diào)節(jié)作用，其活性與蛋白核小球藻多糖的劑量相關(guān)。

近年來，全球面臨能源短缺、資源缺乏和環(huán)境保護(hù)壓力，生物資源的利用和生物能源的開發(fā)引起了廣泛的關(guān)注。小球藻光合效率高、生長速度快、油脂含量高，使其成為開發(fā)生物柴油的重要原料[13]。在小球藻提取油脂之后，剩下的富含多糖的藻渣作為廢棄物，目前沒有有效利用的技術(shù)。

以小球藻藻渣高值化利用為出發(fā)點，開發(fā)小球藻藻渣多糖綠色提取工藝。通過系列糖苷酶和蛋白酶的篩選，發(fā)現(xiàn)一種高效酶法提取藻渣多糖方法，利用正交試驗優(yōu)化藻渣酶法提取多糖的工藝，并構(gòu)建了糖苷酶和蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖的新工藝，實現(xiàn)小球藻藻渣多糖的高效綠色提取，以期為小球藻藻渣高值化開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻藻粉購于山東濱州天健生物科技有限公司；小球藻藻渣(自制)；纖維素酶(2×106U)、果膠酶(2×106U)、半纖維素酶(1×106U)、酒精酶(2×106U)、中性蛋白酶(2×106U)、木瓜蛋白酶(2×106U)、酸性蛋白酶(2×106U)均購于上海和氏璧化工有限公司。BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；濃硫酸、蒽酮、濃鹽酸、氨水、乙酸和乙醇(95%)(國產(chǎn)分析純)。高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；KS-250超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波科生儀器廠)；752型紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LIBROR AEG-120電子天平(日本Shimadzu公司)；超級恒溫器(VJ501)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；pH計(Mettler Toledo)；JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新涇儀器有限公司)；全自動多功能酶標(biāo)儀(Labsystems multiskan Ascent，美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 小球藻藻渣的制備

精確稱取小球藻干粉30 g，加入去離子水1000 mL混勻?；旌弦撼?50 W, 10 min, 2次)破碎。混合液破碎后80 ℃水浴2 h，4500 r/min離心20 min取沉淀，去離子水復(fù)溶重復(fù)以上操作。沉淀用1000 mL去離子水洗3次，4500 r/min離心20 min取沉淀于烘箱中80 ℃干燥24 h，研磨過90目篩即得小球藻藻渣。

1.2.2 提取小球藻藻渣多糖工具酶的篩選

采用糖苷酶(酒精酶、纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶)以及蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶)對小球藻藻渣多糖進(jìn)行提取。具體試驗步驟為：取1 g小球藻藻渣干粉，加入50 mL去離子水混勻，平行3組?；旌弦河靡宜峄虬彼{(diào)節(jié)每種酶的最適pH，然后加入0.02 g酶，在各個酶的最適溫度恒溫攪拌，同時做空白對照。反應(yīng)2、4、6、8、12、24 h時取樣0.5 mL于沸水浴滅酶活，4000 r/min離心10 min，取上清液，測定總糖及蛋白含量，作提取液中總糖及蛋白含量隨反應(yīng)時間變化曲線。

1.2.3 3種酶提取藻渣多糖正交試驗

考慮影響酶法提取多糖反應(yīng)的因素，設(shè)計一個五因素四水平的正交試驗。正交試驗5個因素4個水平，其中A為反應(yīng)液的pH值，B為加酶量(mg)，C為底物含量(%)，D為反應(yīng)溫度(℃)，E為提取時間(h)。

纖維素酶提取藻渣多糖的正交試驗的條件為：pH分別為4.0、4.5、4.8、5.5；加酶量分別為5、10、20、40 mg；底物含量分別為1%、2%、5%、10%；提取溫度分別為40、45、50、55 ℃；提取時間分別為6、12、20、28 h。

果膠酶提取藻渣多糖正交試驗的條件為：pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0；加酶量分別為5、10、20、40 mg；底物含量分別為1%、2%、5%、10%；提取溫度分別為35、40、45、50 ℃；提取時間分別為6、12、20、28 h。

中性蛋白酶提取藻渣多糖正交試驗的條件為：pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0；加酶量分別為5、10、20、40 mg；底物含量分別為1%、2%、5%、10%；提取溫度分別為35、40、45、50 ℃；提取時間分別為6、12、20、28 h。

1.2.4 復(fù)合酶串聯(lián)提取藻渣多糖

根據(jù)正交試驗得出的3種酶的最佳反應(yīng)條件，采用纖維素酶、果膠酶分別與中性蛋白酶復(fù)合串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖，分別在1、2、4、8、12、20、21、22、24、28、32、40 h取樣，0.5 mL于沸水浴滅酶活，4000 r/min離心10 min，取上清液，測定總糖及蛋白含量，作提取液中總糖及蛋白含量隨反應(yīng)時間變化曲線。

1.2.5 總糖含量測定和計算

采用硫酸—蒽酮方法測定多糖提取液的總糖，具體方法參考文獻(xiàn)[14]。計算公式如下：

式中，M為樣品中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的糖質(zhì)量濃度(μg/mL)，V為樣品稀釋后的總體積(mL)，m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.6 小球藻多糖蛋白含量的測定

采用BCA法測定多糖提取液中的蛋白含量，具體方法參考文獻(xiàn)[15]。計算公式如下：

式中，M為樣品中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)，V為樣品稀釋后的總體積(mL)，m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.7 多糖和蛋白提取率計算方法

計算公式如下：

式中，m1為計算出來的多糖或蛋白的質(zhì)量(g)，m2為反應(yīng)時投入的小球藻藻渣樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酶提取藻渣多糖試驗

2.1.1 糖苷酶提取藻渣多糖試驗

用纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶和酒精酶等4種糖苷酶對小球藻藻渣的多糖進(jìn)行提取，反應(yīng)時間曲線見圖1。4種糖苷酶對多糖的提取率分別為6.04%、5.89%、4.89%和3.58%。纖維素酶和果膠酶的效果比較好，這與小球藻的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成[10]吻合。后續(xù)采用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行進(jìn)一步試驗。另外4個糖苷酶在提取多糖時，蛋白含量也隨時間延長而增加，其含量分別為2.11%、2.01%、2.61%和2.30%(圖1)。對多糖提取液進(jìn)行多種蛋白去除處理，發(fā)現(xiàn)均未能有效去除，說明小球藻藻渣的多糖可能含有蛋白聚糖。為此，進(jìn)一步嘗試采用蛋白酶提取其多糖。

圖1 單一糖苷酶提取小球藻藻渣多糖時間曲線a:纖維素酶；b：果膠酶；c：半纖維素酶；d：酒精酶.

2.1.2 單一蛋白酶提取藻渣多糖試驗

用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶對小球藻藻渣多糖提取反應(yīng)的時間曲線見圖2，多糖提取率分別為12.24%、6.64%和7.02%，同時蛋白的提取率為8.14%、4.19%和3.60%，說明小球藻藻渣中多糖確實含有蛋白聚糖。3種蛋白酶中，中性蛋白酶的活性遠(yuǎn)高于其他兩種蛋白酶，后續(xù)的試驗中采用中性蛋白酶進(jìn)行試驗。

圖2 單一蛋白酶提取小球藻藻渣多糖時間曲線a：中性蛋白酶；b：木瓜蛋白酶；c：酸性蛋白酶.

2.2 3種酶提取藻渣多糖的正交試驗

單一酶提取小球藻藻渣多糖的試驗表明，糖苷酶中纖維素酶和果膠酶以及中性蛋白酶的提取效率較好。為進(jìn)一步提高3種酶對小球藻藻渣多糖的提取效率，筆者對3種酶提取多糖進(jìn)行正交試驗優(yōu)化。

2.2.1 纖維素酶正交試驗

纖維素酶提取小球藻藻渣多糖正交試驗的條件見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 纖維素酶提取小球藻藻渣多糖反應(yīng)的正交試驗條件

表2 纖維素酶正交試驗的結(jié)果

正交試驗中極差表示指定因素1～4組平均值的最大值與最小值的的差，極差值的大小體現(xiàn)此因素對提取過程的影響程度(表2)。加酶量的極差最大，其值為4.58(9.03～4.45)，表明提取過程的加酶量對小球藻藻渣多糖的提取影響最大。在加酶量因素的4個水平的平均值中，水平4的平均值最大，因此確定此提取過程的最適加酶量為40 mg。試驗16的多糖提取率最大，為10.78%。因此初步確定的最佳提取條件為：反應(yīng)液pH 5.5；加酶量40 mg；底物含量1%；提取液溫度50 ℃；提取時間20 h。

根據(jù)正交試驗結(jié)果的方差分析表分析得出，pH值、加酶量、底物含量、溫度、時間對反應(yīng)的影響均不顯著(表3)。

表3 纖維素酶正交試驗方差分析

2.2.2 果膠酶正交試驗

果膠酶提取小球藻藻渣多糖正交試驗的條件見表4，正交試驗結(jié)果見表5。

表4 果膠酶提取小球藻藻渣多糖反應(yīng)的正交試驗條件

表5 果膠酶正交試驗的結(jié)果

反應(yīng)溫度的極差最大，其值為2.03(8.96～6.93)，表示提取過程的溫度對小球藻藻渣多糖的提取影響最大(表5)。在反應(yīng)溫度因素的4個水平的平均值中，水平1的平均值最大，因此確定此提取過程的最適溫度為35 ℃。試驗12組的多糖提取率最大，為11.53%。因此初步確定的最佳提取條件為：反應(yīng)液pH 4.5；加酶量40 mg；底物含量2%；提取溫度35 ℃；提取時間20 h。

根據(jù)正交試驗結(jié)果的方差分析表分析得出，pH、加酶量、底物含量、溫度、時間對反應(yīng)的影響都均不顯著(表6)。

表6 果膠酶正交試驗方差分析

2.2.3 中性蛋白酶正交試驗

中性蛋白酶提取小球藻藻渣多糖正交試驗的條件見表7，正交試驗結(jié)果見表8。

加酶量的極差最大，其值為4.63(10.25～5.62)，表示提取過程的加酶量對小球藻藻渣多糖的提取影響最大(表8)。在加酶量因素的4個水平的平均值中，水平4的平均值最大，因此確定此提取過程的加酶量為40 mg。試驗12組的多糖提取率最大，為17.71%。因此初步確定的最佳提取條件為：提取液pH 7.5；加酶量40 mg；底物含量2%；提取溫度35 ℃；提取時間20 h。

根據(jù)正交試驗結(jié)果的方差分析表分析得出，pH值、加酶量、底物含量、溫度、時間對反應(yīng)的影響都不顯著(表9)。

2.3 雙酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖

由于小球藻藻渣中多糖含有蛋白聚糖，糖苷酶和蛋白酶組成的復(fù)合酶能提高多糖的提取率。根據(jù)正交試驗優(yōu)化后的試驗條件，采用纖維素酶和中性蛋白酶串聯(lián)以及果膠酶和中性蛋白酶串聯(lián)的方法。兩種雙酶串聯(lián)法提取小球藻藻渣多糖的反應(yīng)時間曲線(圖3、圖4)。

由圖3和圖4可見，采用纖維素酶和中性蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖提取率為20.80%，果膠酶和中性蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖的提取率為20.19%，遠(yuǎn)高于單個酶的提取效率，也明顯高于兩個酶單獨提取率的加和，提取率提高近一倍。

表7 纖維素酶提取小球藻藻渣多糖反應(yīng)的正交試驗條件

表8 果膠酶正交試驗的結(jié)果

表9 中性蛋白酶正交試驗方差分析

圖3 纖維素酶和中性蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖

圖4 果膠酶和中性蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖

3 討 論

3.1 單一酶提取藻渣多糖試驗

提取藻渣多糖通常采用堿提[16]和超聲輔助提取[17-18]的方法，但是這些方法存在條件苛刻、設(shè)備腐蝕和產(chǎn)物后處理繁瑣的問題。生物酶法提取多糖具有條件溫和、效率高和過程綠色的優(yōu)勢，近年來廣受關(guān)注。本試驗針對小球藻藻渣多糖結(jié)構(gòu)的特點[19],首先篩選了4種糖苷酶，包括纖維素酶、果膠酶、酒精酶、半纖維素酶，研究其對小球藻藻渣多糖的提取效果，發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶的效果較好。這與小球藻藻渣主要含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖等中性糖和果膠、半纖維素較少的特點吻合[20]。在糖苷酶提取多糖的過程中，隨著提取液中多糖含量的增加，蛋白含量也隨之增加，對多糖提取液進(jìn)行多種方法除蛋白處理，發(fā)現(xiàn)均未能有效去除，說明小球藻藻渣的多糖可能含有蛋白聚糖。采用3種蛋白酶包括中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶提取小球藻藻渣多糖，3種蛋白酶均具有活性，其中中性蛋白酶的活性最高。與糖苷酶提取多糖過程類似，隨著提取液中蛋白含量的升高，多糖的含量也隨著升高?；诖私Y(jié)果，采用糖苷酶和蛋白酶組成的復(fù)合酶提取可能會大大提高多糖的提取率。

3.2 3種酶提取藻渣多糖的正交試驗

酶法提取多糖過程涉及多個因素，包括反應(yīng)液pH值、加酶量、底物含量、提取液溫度和提取時間。正交試驗是多因素試驗的有效優(yōu)化工具[21]，筆者對篩選出的3種酶，包括纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶對小球藻藻渣多糖的提取過程進(jìn)行了正交試驗優(yōu)化。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)方差分析，pH值、加酶量、底物含量、溫度和時間對提取過程的影響均不顯著，但是優(yōu)化后3種酶的提取效率均得到明顯提高，中性蛋白酶的提取率提高近40%，而兩個糖苷酶的提取率更是由約6%提至約11%，果膠酶的提取率更是提高超過一倍。正交試驗的結(jié)果為糖苷酶—蛋白酶復(fù)合串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖奠定了基礎(chǔ)。

3.3 雙酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖

小球藻藻渣中的多糖含有蛋白聚糖，采用糖苷酶和蛋白酶復(fù)合提取效率會高于單一酶的提取效率。如果蛋白酶與糖苷酶同時加入，蛋白酶會將糖苷酶降解。因此，本試驗采取先用糖苷酶、后用蛋白酶的雙酶串聯(lián)法提取小球藻藻渣多糖。采用正交試驗優(yōu)化后的提取工藝條件，纖維素酶和中性蛋白酶串聯(lián)以及果膠酶和中性蛋白酶串聯(lián)提取小球藻藻渣多糖的工藝，多糖提取率分別達(dá)到20.80%及20.19%，遠(yuǎn)高于單一酶的提取效率，也明顯高于兩個酶單獨試驗時提取率的加和，提取率提高近一倍；在提取時間上，復(fù)合酶串聯(lián)提取工藝也短于兩個單一酶提取時間之和。

由試驗結(jié)果可以看出，本研究開發(fā)的糖苷酶—蛋白酶雙酶串聯(lián)提取工藝可在溫和條件下，高效綠色提取小球藻藻渣中的多糖，為后續(xù)小球藻藻渣多糖的生物活性研究及進(jìn)一步高值化利用開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)小球藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時，雙酶串聯(lián)提取多糖工藝對其他資源多糖的提取利用過程具有借鑒意義。

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