王 琰，高四合，單建杰，羅 璋，劉金蘭

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221 )

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用菌株L1分離自有典型臨床出血癥狀的半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)，由天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)動物病害實驗室保種。斑馬魚購自天津市中環(huán)花鳥魚蟲市場，全長為3.0～3.5 cm，均健康無病，經(jīng)過1周暫養(yǎng)，待試驗魚穩(wěn)定后，用于試驗。

1.2 16S rDNA鑒定

1.2.1 制備模板

將菌株L1用2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期(12 h)，按照天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌總DNA提取試劑盒(DP302-02)說明書步驟操作，提取細(xì)菌總DNA，即為模板DNA。

1.2.2 16S rDNA基因序列的擴增

擴增16S rDNA基因所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物27 F和1492 R。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：2×Taq PCR Mix(天根)25 μL，25 μmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用滅菌超純水調(diào)整終體積至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，并送交上海生工生物技術(shù)工程有限公司進(jìn)行基因測序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株L1的16S rDNA基因序列與GenBank中已報道的核酸序列進(jìn)行在線Blast分析，調(diào)出與該序列同源性較高的核酸序列，并與通過LPSN下載的相關(guān)菌株16S rDNA基因序列及同種不同株系的16S rDNA基因序列進(jìn)行比較。將上述序列使用Mega 5.2完成序列比對后，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 蠟樣芽孢桿菌6種主要毒力基因PCR檢測

蠟樣芽孢桿菌的6種主要毒力基因為：與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素BL基因(hblC)、腸毒素T基因(bceT)、細(xì)胞毒素K基因(CytK)、嘔吐基因(ces)、多效調(diào)控因子(plcR)、非溶血性腸毒素(nheA)。引物序列、退火溫度及擴增片段大小見表1，引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成，PCR反應(yīng)體系和產(chǎn)物電泳檢測和測序與1.2.2相同。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.4 胞外酶及溶血素定性分析

參照文獻(xiàn)[12]胞外酶及溶血素定性分析中的方法，將菌株L1接種到2216E培養(yǎng)基上，經(jīng)30 ℃恒溫培養(yǎng)(24 h)后觀察結(jié)果。溶血素培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%家兔脫纖維血)，若菌落周圍出現(xiàn)透明的血圈為陽性，反之為陰性。蛋白酶培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%脫脂牛奶)，若菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)環(huán)，可在其表面滴加1%氯化汞溶液，如仍保持不變?yōu)殛栃?。脂肪酶培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%吐溫80)，菌落周圍有白色沉淀帶，則含脂肪酶。淀粉酶培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%淀粉)，于菌落上滴加I2-KI觀察結(jié)果。若有淀粉酶，菌落周圍培養(yǎng)基變透明。若無淀粉酶，則培養(yǎng)基與碘反應(yīng)出現(xiàn)紫色。尿素酶培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%尿素和1%酚紅)，若菌落含尿素酶，尿素酶水解尿素使培養(yǎng)基成堿性，酚紅顯色成粉紅色。

1.5 半數(shù)致死密度測定

試驗分6組，每組2個平行，每個平行15尾斑馬魚。取菌株L1經(jīng)普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋成密度為1.00×109、1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105cfu/mL菌液。分別腹腔注射每組魚體，每尾10 μL。對照組注射等量的生理鹽水。注射后，每日觀察死亡情況。采用概率單位法計算半數(shù)致死密度。

1.6 藥敏試驗

參照《藥品微生物學(xué)檢驗手冊》采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗，藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司，并根據(jù)說明書對敏感度進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA與16S rDNA擴增結(jié)果

自菌株L1提取的DNA條帶單一完整、明亮(圖1a)。經(jīng)通用引物擴增后的16S rDNA片段大小為1375 bp(圖1b)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用鄰接法基于菌株L1的16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可見，菌株L1與蠟樣芽孢桿菌X2、EB-31為同一支，親緣關(guān)系較近，相似性為99%。

2.3 毒力基因的檢測及序列分析

經(jīng)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)L1的DNA中除ces外，存在CytK、bceT、hblC、plcR、nheA 5種毒力基因。并測得5種毒力基因片段大小分別為537、400、669、581、477 bp(圖3)。

圖1 凝膠電泳圖譜a. L1基因組DNA的凝膠電泳圖譜；b. L1 16SrDNA基因擴增電泳圖譜注：M：MakerⅢ；A中1,2：L1基因組DNA；B中1～4：16SrDNA PCR產(chǎn)物.

圖2 菌株L1的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株L1毒力基因擴增電泳圖譜M，MakerⅢ；1，CytK；2，bceT；3，hblC；4，ces；5，PlcR；6，nheA.

2.4 胞外酶及溶血素活性

溶血素培養(yǎng)基中菌落周圍可以明顯看到透明的溶血圈(圖4a)，因此表明菌株L1中含溶血素；培養(yǎng)48 h后蛋白酶培養(yǎng)基中菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)環(huán)，在其表面滴加1%氯化汞溶液，透明區(qū)環(huán)保持透明不變，則菌株L1中含蛋白酶(圖4b)；在淀粉酶培養(yǎng)基中菌落上滴加I2-KI，菌落周圍培養(yǎng)基變透明(圖4c)，表明菌株L1中含淀粉酶；脂肪酶培養(yǎng)基中菌落周圍出現(xiàn)白色沉淀帶(圖4d)，表明菌株L1中含脂肪酶；尿素酶培養(yǎng)基上，劃線部分變粉紅，試管下部未接種細(xì)菌部分不變粉紅，表明菌株L1含尿素酶(圖4e)。綜上所述，經(jīng)檢測菌株L1胞外酶含溶血素、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、尿素酶。

2.5 半數(shù)致死密度的測定

以不同細(xì)菌密度人工注射斑馬魚，養(yǎng)殖24 h后，高于1.00×105cfu/mL密度組開始出現(xiàn)死亡，而1.00×105cfu/mL密度組和對照組死亡率為0。試驗結(jié)果見表2，經(jīng)計算96 h半數(shù)致死密度為3.26×108cfu/mL。

死亡斑馬魚腹部紅腫，皮膚充血、出血、潰爛，與患細(xì)菌性疾病的半滑舌鰨的癥狀相吻合。在死亡斑馬魚病灶處分離出優(yōu)勢菌，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

2.6 藥敏試驗

蠟樣芽孢桿菌L1對30種常見抗生素的藥物敏感性結(jié)果見表3，結(jié)果顯示，蠟樣芽孢桿菌L1對頭孢他啶、氨曲南、阿莫西林等10種藥物耐藥，對紅霉素、環(huán)丙沙星、多粘菌素B等5種藥物中度敏感，對慶大霉素、克林霉素、阿米卡星等15種藥物敏感。

表2 半數(shù)致死密度測定試驗結(jié)果

圖4 溶血素和胞外酶的活性檢測試驗結(jié)果a溶血素，b蛋白酶，c淀粉酶，d脂肪酶，e尿素酶.

抗生素抑菌圈直徑/mm敏感性抗生素抑菌圈直徑/mm敏感性頭孢他啶11．5±0．4R慶大霉素23．2±0．6S頭孢噻肟6．0±0．5R克林霉素24．3±0．2S頭孢唑啉9．0±0．4R阿米卡星26．2±0．4S頭孢曲松0．0±0．0R新霉素20．1±0．3S頭孢呋辛0．0±0．0R鏈霉素22．5±0．7S氨曲南0．0±0．0R麥迪霉素27．3±0．3S阿莫西林0．0±0．0R妥布霉素17．4±0．7S氨芐西林0．0±0．0R卡那霉素20．4±0．3S復(fù)方新諾明0．0±0．0R哌拉西林21．3±0．5S青霉素G0．0±0．0R左氟沙星22．1±0．2S紅霉素20．8±0．7I頭孢哌酮24．9±0．4S環(huán)丙沙星20．3±0．2I萬古霉素17．5±0．01S米諾環(huán)素18．7±0．2I大觀霉素21．4±0．3S多粘菌素B10．0±0．3I氧氟沙星23．3±0．2S頭孢西丁15．3±0．1I阿奇霉素18．0±0．2S

注：R，耐藥；I，中度敏感；S，敏感.

3 討 論

3.1 蠟樣芽孢桿菌16S rDNA鑒定

3.2 蠟樣芽孢桿菌的毒力基因

蠟樣芽胞桿菌毒力基因和潛在的致病性研究，國內(nèi)外已有不少報道，多數(shù)集中于陸上動物及食品檢測中[3,4,13,18]。已有研究表明，分離到的蠟樣芽孢桿菌主要含與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素BL基因、腸毒素T基因、細(xì)胞毒素K基因、多效調(diào)控因子、非溶血性腸毒素和與嘔吐相關(guān)的嘔吐基因[6,18]，其中溶血素BL基因具有溶血性、細(xì)胞毒性，可引起皮膚潰爛、潰瘍和充血、淤血等癥狀[5,19]；腸毒素T基因控制腸毒素蛋白的合成[5,20]；細(xì)胞毒素K基因?qū)θ祟惸c道上皮細(xì)胞具有毒性作用[5,21]；多效調(diào)控因子可以激活多種編碼毒力基因的表達(dá)，例如可以編碼磷脂酶C、蛋白酶和溶血素等基因的表達(dá)[6]；非溶血性腸毒素可以控制一種金屬蛋白，該蛋白具有分解明膠和膠原的活力[5,22]；嘔吐基因可以產(chǎn)生嘔吐毒素，該毒素能保持完整并且轉(zhuǎn)化為活性毒素吸附在內(nèi)臟[5,18]。本試驗自蠟樣芽孢桿菌L1基因組中檢測到溶血素BL基因、腸毒素T基因、細(xì)胞毒素K基因、多效調(diào)控因子和非溶血性腸毒素5種與腹瀉相關(guān)的毒力基因，未檢測到與嘔吐相關(guān)的嘔吐基因。因多效調(diào)控因子和細(xì)胞毒素K基因可引起皮膚的潰爛、充血和淤血等癥狀，與功毒后死亡斑馬魚的癥狀相吻合；而細(xì)胞毒素K基因又能激活溶血素BL基因的表達(dá)，從而加速溶血素的產(chǎn)生，危害魚類健康。綜上所述，蠟樣芽孢桿菌所含的5種毒力因子共同作用其毒素的產(chǎn)生。

3.3 蠟樣芽孢桿菌的胞外產(chǎn)物

本試驗自蠟樣芽孢桿菌L1的胞外產(chǎn)物中檢測到了分泌到機體組織而引起組織細(xì)胞的壞死，繼而使動物發(fā)病甚至死亡的胞外酶如溶血素、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和尿素酶。且被攻毒的斑馬魚出現(xiàn)水腫、充血乃至死亡，這與胞外蛋白酶分解宿主組織蛋白質(zhì)，溶血素可導(dǎo)致機體出血，形成全身性毒血癥、敗血癥等[23]，脂肪酶能分解脂質(zhì)[24]和尿素酶能分解尿素產(chǎn)生NH3，在菌體周圍形成堿性環(huán)境[25]等病理機制相一致。這些結(jié)果表明該菌株對水產(chǎn)動物具有很強的致病性。

3.4 蠟樣芽孢桿菌的攻毒試驗

斑馬魚(Daniorerio)是一種理想的脊椎動物模式生物，被認(rèn)為是一種監(jiān)測水體污染物的動物模型, 用于檢測致畸性和有毒物質(zhì)[26]。本試驗經(jīng)測定96 h半數(shù)致死密度為3.26×108cfu/mL，可見其毒力相對較弱。死亡斑馬魚的現(xiàn)象與患病半滑舌鰨相吻合，分離出的細(xì)菌經(jīng)證實為蠟樣芽孢桿菌，說明該菌不僅有使半滑舌鰨患病的能力，還能引起水中其他生物的疾病。國標(biāo)急性毒性試驗測出的試驗結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，但是時間久、可重復(fù)性差[27]，因此可以與分子生物學(xué)方面毒力基因的檢測結(jié)合，更快速、準(zhǔn)確的檢測細(xì)菌毒力。

3.5 蠟樣芽孢桿菌的藥敏試驗

本試驗中的藥敏試驗結(jié)果顯示蠟樣芽孢桿菌L1對慶大霉素、克林霉素、阿米卡星等15種藥物敏感。為臨床上可選用藥物來預(yù)防或治療蠟樣芽孢桿菌引起的疾病提供參考，且應(yīng)該在國家漁業(yè)藥用準(zhǔn)則允許的條件下，有針對性地選擇藥物用于疾病防治。

來源于水環(huán)境的蠟樣芽孢桿菌盡管攜帶溶血素BL基因、腸毒素T基因、細(xì)胞毒素K基因等毒力基因并能分泌溶血素毒素，其能否通過魚源食材傳染恒溫的陸上動物并在陸上動物體內(nèi)增殖繼而引起陸上動物中毒即為下一步的研究方向。

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