袁 瑞，楊 寧，姜 秦，王正麗

( 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109 )

魚粉是水產(chǎn)飼料的優(yōu)質(zhì)蛋白源，然而，近年來(lái)過(guò)度捕撈和不良?xì)夂蚴刽~粉產(chǎn)量降低，魚粉價(jià)格逐年增長(zhǎng)[1]。尋找優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的替代蛋白源成為水產(chǎn)飼料研究的主要問題之一。大豆蛋白消化吸收率高、價(jià)格低、資源豐富，可作為替代蛋白源成為研究熱點(diǎn)[2]。

但是，大豆蛋白中所含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子限制了其利用[3]。其中大豆異黃酮屬于黃酮類化合物，是大豆中較為常見的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在飼料中超過(guò)一定劑量對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、健康及對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率均有負(fù)面作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中豆粕對(duì)魚粉的替代水平超過(guò)75%時(shí)，影響羅非魚(Oreochromissp.)的生長(zhǎng)、消化酶和轉(zhuǎn)氨酶活性，而這與豆粕中所含的抗?fàn)I養(yǎng)因子大豆異黃酮的含量相關(guān)[4]；在飼料中添加1～3 g/kg大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但添加量達(dá)到4 g/kg時(shí)，顯著抑制褐牙鲆生長(zhǎng)[5]。也有研究表明，飼料中適量的大豆異黃酮對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用[6-8]。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中大豆異黃酮含量的增加，卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)的生長(zhǎng)性能顯著提高，40 mg/kg為最適添加量，添加量達(dá)60～80 mg/kg時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。而對(duì)陸生動(dòng)物中的研究則表明，除了影響生長(zhǎng)，大豆異黃酮無(wú)論在體內(nèi)或體外還具有免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]，能夠提高小鼠的殺傷細(xì)胞反應(yīng)[11]、調(diào)節(jié)人類的細(xì)胞免疫[12]等。但目前有關(guān)大豆異黃酮對(duì)魚類影響的研究多集中在豆粉替代魚粉后對(duì)魚類生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響上，研究結(jié)果也存在較大的差異。大豆異黃酮是否具有增強(qiáng)魚類免疫的作用及其相關(guān)機(jī)理仍不明確。因此，為進(jìn)一步研究大豆異黃酮對(duì)魚類的免疫效應(yīng)，筆者建立了離體細(xì)胞模型，研究了離體條件下大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆相關(guān)免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)。

褐牙鲆是我國(guó)北方沿海地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的重要海水魚類之一[13]。頭腎巨噬細(xì)胞[14]和外周血白細(xì)胞[15]是褐牙鲆重要的免疫細(xì)胞，在褐牙鲆免疫過(guò)程中起重要作用。本試驗(yàn)旨在研究大豆異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞免疫力的影響，明確大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆的免疫細(xì)胞是否具有免疫促進(jìn)抑或抑制作用，為大豆異黃酮在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中的添加以及植物蛋白源的合理開發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。為尋求新的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料原料替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用褐牙鲆購(gòu)自日照某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量(250±12) g，健康無(wú)傷，暫養(yǎng)于海水循環(huán)系統(tǒng)中。水溫17～19 ℃，鹽度32～40，溶氧8.0 mg/L以上，每日投喂商品飼料兩次。

1.2 細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.2.1 褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在超凈臺(tái)內(nèi)剖取褐牙鲆頭腎，研磨備用。采用Ortuńo的方法分離褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞[16]，將頭腎研磨液過(guò)100目篩絹，加入到34%/51% percoll(Solarbio公司)分離液的液面，4 ℃，2200 r/min離心25 min，吸取中間層巨噬細(xì)胞；然后加入3 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液，1200 r/min離心5 min后洗滌兩次，加入2% FBS-L-15(添加1%雙抗、4%抗凝劑、2%胎牛血清)重懸得巨噬細(xì)胞。

1.2.2 外周白細(xì)胞的分離

在無(wú)菌條件下，用含有抗凝劑的注射器尾靜脈抽血，分離外周血白細(xì)胞[17]。取稀釋血液加入到60% Percoll分離液液面上，4 ℃，2200 r/min離心25 min后，從上到下依次為血漿層、白細(xì)胞層、粒細(xì)胞層、紅細(xì)胞層，于白細(xì)胞層輕輕吸取白細(xì)胞；加入3 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液，1200 r/min離心5 min后洗滌兩次，用2% FBS-L-15重懸得白細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及培養(yǎng)

用臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)分離頭腎細(xì)胞和白細(xì)胞活性[16]，用2% FBS-L-15培養(yǎng)基調(diào)整這兩種細(xì)胞的密度為107個(gè)/mL，分別接種到96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞液，放置于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄上清液以去除未貼壁細(xì)胞，然后分別加入100 μL含有0、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL大豆異黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(添加不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮的2% FBS-L-15培養(yǎng)基)，放于19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個(gè)梯度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 免疫指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 氧呼吸爆發(fā)活力測(cè)定

采用Dolmatova[18]的方法稍作修改。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液上清，每孔中加入100 μL氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液[質(zhì)量濃度為1 mg/mL，含有10 μL 1 mg/mL的乙酸肉豆蔻佛波醇]，在19 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育40 min后吸棄上清液，加入200 μL 100%甲醇固定10 min，用200 μL 70%甲醇洗滌細(xì)胞兩次后每孔加入120 μL KOH(2 mol/L)和140 μL二甲基亞砜(100%)，用酶標(biāo)儀在620 nm測(cè)定吸光值。

1.3.2 增殖活力測(cè)定

采用MTT法[19]稍作修改。不同細(xì)胞中加入10 μL噻唑藍(lán)(5 mg/mL MTT)，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(100%)，用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)定吸光值。

1.3.3 吞噬活力的測(cè)定[19-20]

1.3.3.1 頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活力

在每孔細(xì)胞中加入20 μL密度為5×108cfu/mL的自制鰻弧菌懸液，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h；吸棄上清液后再每孔加100 μL 0.2%的吐溫-20，反應(yīng)10 min后加10 μL噻唑藍(lán)(MTT 5 mg/mL)，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；吸棄上清液后，每孔再加150 μL二甲基亞砜(100%)10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定吸光值。

1.3.3.2 外周血白細(xì)胞吞噬活力

將培養(yǎng)后的外周血白細(xì)胞96孔板1000 r/min離心，吸棄上清液。每孔加入0.075%的中性紅溶液100 μL，19 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；離心棄上清液，用200 μL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液洗凈未被吞噬的中性紅；每孔加150 μL細(xì)胞裂解液(乙酸∶無(wú)水乙醇=1∶1)，19 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定510 nm下的吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，進(jìn)行Duncan多重比較。

2 結(jié) 果

在體外培養(yǎng)條件下，大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞免疫力有顯著影響(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞免疫力呈先增加后降低的趨勢(shì)。

2.1 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮在體外對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞免疫力的影響

2.1.1 對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)中不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活力(P<0.05)(圖1)。當(dāng)大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，褐牙鲆巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力顯著高于對(duì)照組和其他處理組(P<0.05)，而最高質(zhì)量濃度組(2 mg/mL)的氧呼吸爆發(fā)活力顯著低于最低質(zhì)量濃度組(0.1 mg/mL)(P<0.05)，其他處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮在體外對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

2.1.2 對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞增殖活力的影響

細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0 mg/mL時(shí)，褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞增殖活力顯著增加(P<0.05)，在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)活力最高；隨著大豆異黃酮質(zhì)量濃度的增加，褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞增殖活力顯著降低，當(dāng)大豆異黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，頭腎巨噬細(xì)胞增殖活力最低，顯著低于對(duì)照組和其他處理組(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮在體外對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞增殖活力的影響

2.1.3 對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)，褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活力顯著高于對(duì)照組和其他處理組(P<0.05)，質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL時(shí)值最高；而當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，褐牙鲆巨噬細(xì)胞的吞噬活力值最低(P<0.05)(圖3)。

2.2 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮在體外對(duì)褐牙鲆外周血白細(xì)胞免疫力的影響

2.2.1 對(duì)褐牙鲆外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力(P<0.05)，當(dāng)培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg/mL時(shí)，白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.1、1.5 mg/mL處理組則與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖3 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮在體外對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力的影響

2.2.2 對(duì)褐牙鲆外周血白細(xì)胞增殖活力的影響

培養(yǎng)液中添加不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮顯著增強(qiáng)了褐牙鲆外周血白細(xì)胞的增殖活力(P<0.05)，且大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，白細(xì)胞增殖活力值最高(圖5)。

2.2.3 對(duì)褐牙鲆外周血白細(xì)胞吞噬活力的影響

不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮顯著影響了褐牙鲆外周血白細(xì)胞的吞噬活力(P<0.05)(圖6)，大豆異黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)褐牙鲆外周血白細(xì)胞吞噬活力最高，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)；隨著培養(yǎng)液中大豆異黃酮質(zhì)量濃度的增加，褐牙鲆外周血白細(xì)胞吞噬活力顯著降低，當(dāng)大豆異黃酮質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，白細(xì)胞吞噬活力最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05)。

圖5 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細(xì)胞的增殖活力

圖6 不同質(zhì)量濃度大豆異黃酮下褐牙鲆外周血白細(xì)胞的體外吞噬活力

3 討 論

大豆異黃酮是大豆中主要的植物雌激素，是一種具有類雌激素性質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)因子[7]。研究表明，動(dòng)物飼糧中添加適量的大豆異黃酮能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低飼料成本，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[21]。日糧中添加大豆異黃酮能夠促進(jìn)蛋雞免疫器官發(fā)育，提高免疫功能[22]；大豆異黃酮顯著影響了仔豬生長(zhǎng)、免疫性能等[8]。但是，大豆異黃酮在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究較少，Tzchori等[23]在飼料中添加2、20 μg/g的大豆異黃酮促進(jìn)了歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)的生長(zhǎng)；張偉[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中大豆異黃酮含量在4800 μg/g以下時(shí)，對(duì)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，而當(dāng)含量超過(guò)7200 μg/g時(shí)，則顯著抑制異育銀鯽的生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，離體條件下大豆異黃酮顯著影響褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的免疫力。培養(yǎng)液中大豆異黃酮的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，顯著促進(jìn)了褐牙鲆相關(guān)免疫活力；但大豆異黃酮質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加，褐牙鲆的免疫力反而下降，在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)大豆異黃酮質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，褐牙鲆的細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力、巨噬細(xì)胞增殖活力和吞噬活力降低，培養(yǎng)液中高質(zhì)量濃度的大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆的細(xì)胞免疫力表現(xiàn)出抑制作用。

頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞均屬于魚類主要的吞噬細(xì)胞，其對(duì)免疫的影響主要體現(xiàn)在呼吸爆發(fā)活力、增殖活力和吞噬活力。顆粒與吞噬細(xì)胞的結(jié)合或其它可溶性物質(zhì)的刺激可以激發(fā)吞噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧[超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)等]。這些活性氧殺滅細(xì)菌和微生物的過(guò)程即為呼吸爆發(fā)[24]。在本試驗(yàn)中，大豆異黃酮在體外增強(qiáng)了頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活力，增強(qiáng)效果隨質(zhì)量濃度的增加先升后降。Disilvestro等[25]曾報(bào)道大豆異黃酮可以提高人體紅細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶的活性；Zhou等[6]研究也表明，添加大豆異黃酮改善了機(jī)體抗氧化狀態(tài)，抑制自由基的形成，從而減少脂質(zhì)超氧化物的形成。因此大豆異黃酮對(duì)細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的影響可能主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生上。但大豆異黃酮對(duì)呼吸爆發(fā)活力的影響有一個(gè)閾值，當(dāng)添加量超過(guò)一定值則產(chǎn)生抑制作用。吞噬細(xì)胞為魚體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，外來(lái)微生物入侵后即開始增殖以殺死外來(lái)入侵微生物[26]；吞噬作用是細(xì)胞內(nèi)消化、殺滅和消化入侵的微生物過(guò)程，這包括了顆粒與細(xì)胞表面接觸、消化形成吞噬體以及分解吞噬體中的顆粒三個(gè)步驟[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆異黃酮顯著影響頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的增殖活力及吞噬活力。Tang等[28]發(fā)現(xiàn)，異黃酮衍生物可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞的形成，可以推論大豆異黃酮可以通過(guò)介導(dǎo)與細(xì)胞增殖和吞噬作用相關(guān)的蛋白表達(dá)來(lái)影響其活力，或者是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的完成來(lái)影響巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的增殖活力。

本試驗(yàn)在離體條件下，在培養(yǎng)液中添加大豆異黃酮培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞，顯示添加不同質(zhì)量濃度的大豆異黃酮對(duì)褐牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的免疫效果具有顯著影響，推測(cè)存在一個(gè)促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的適宜大豆異黃酮質(zhì)量濃度，為進(jìn)一步在飼料中添加大豆異黃酮，促進(jìn)動(dòng)物免疫的研究提供了參考。但飼料中大豆異黃酮的影響受機(jī)體更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制作用，也與魚的種類、規(guī)格、性別、食性、生理狀態(tài)、養(yǎng)殖系統(tǒng)等多種因素影響，其作用效果和機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。

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