周 迪，楊旭夫，彭 凌

(韶關學院 粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心/中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關學院動物疫病診斷中心聯(lián)合實驗室，廣東韶關512005)

近年來多重耐藥菌株的出現(xiàn)引起了科研人員的廣泛關注，尋求解決細菌耐藥性的有效防治方法迫在眉睫。細菌素(Bacteriocin)是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類對它種細菌尤其是與產(chǎn)生菌親緣關系密切的細菌種有抑殺作用的肽類或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。細菌素產(chǎn)生菌對其自身產(chǎn)生的細菌素具有免疫力，這種免疫力通常是由伴隨細菌素結構基因表達的免疫系統(tǒng)賦予的[1-2]。細菌素不僅多樣性豐富，而且普遍認為其對真核細胞無毒副作用，由于其能被消化性蛋白酶消化，對腸道正常菌群也無影響[3]，因此其對人和動物是安全的。革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的多種細菌素均表現(xiàn)出相當廣泛的抑殺菌活性，具有成為未來抗菌藥物的潛能[4-5]。葡萄球菌素是葡萄球菌產(chǎn)生的細菌素的統(tǒng)稱，國內(nèi)外研究表明，葡萄球菌素在臨床治療和食品防腐方面均表現(xiàn)出潛在的應用價值。Jiang在評估高聚葡萄球菌素和順鉑液對心包積液肺癌患者的臨床治療效果時發(fā)現(xiàn)，心包腔內(nèi)注射高聚葡萄球菌素和順鉑液是控制患者心包積液比較好的一種治療方法[6]。Fontana等在研究由表皮葡萄球菌產(chǎn)生的葡萄球菌素Pep5和表皮素(Epidermin)對醫(yī)用導管感染的表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌臨床分離株抑制作用顯示，2種葡萄球菌素不僅在濃度為640活力單位/mL能夠抑制多個臨床分離株，且能顯著降低細菌對導管的粘附作用，從而為控制導管相關性感染提供了一種新策略[7]。牛莫拉克氏菌引起的犢牛傳染性結膜炎是一種具有重大經(jīng)濟意義的疾病，用于預防該病的多種商品疫苗的效力均不理想，藥物防治中耐藥菌株的出現(xiàn)加重了對該病防治的困難。有研究表明，Bac1829、BacR1和金葡菌素A53能夠抑制牛莫拉克氏菌，且Bac1829和BacR1對該菌的抑制作用尤為顯著，因此這些葡萄球菌素為開發(fā)牛莫拉克氏病新的治療藥物提供了可能[2]。豬葡萄球菌產(chǎn)生的細菌素樣活性物質(zhì)4244，能夠在一種食物內(nèi)同時抑制食源性病原菌如單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌，提示其有開發(fā)成為食品防腐劑的潛能[1]。

本研究以糞纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)作為指示菌[8]測試分離菌株，獲得多株能夠產(chǎn)生抑殺該指示菌活性物質(zhì)的菌株。同時測試活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株對不同動物細菌性病原菌的抑制作用，挑選2株對指示菌抑制作用明顯且對紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)有較強抑殺作用的菌株作為研究對象，鑒定產(chǎn)生菌并初步研究其活性物質(zhì)的生物學性質(zhì)，為進一步篩選具有高效抑殺活性的細菌素及細菌素的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 指示菌及主要實驗材料C.fimiNCTC7547株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；9型豬鏈球菌(SS9)、Ⅳ型胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和紅斑丹毒絲菌等菌株，均為本實驗室分離鑒定并收藏；TSA和TSB培養(yǎng)基，為本實驗室自制；各類細菌微量生化反應管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；DNA Marker、瓊脂糖和蛋白酶K均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶(牛胰)和鏈霉蛋白酶購自廣州齊云生物技術有限公司。

1.2 細菌樣本的采集和分離培養(yǎng) 將TSA瓊脂平板敞開置于韶關市某市場中心，放置5 min，收集空氣樣本；用棉拭子擦拭活雞皮膚表面，或?qū)㈦u身上灰塵樣品抖落于TSA平板表面；利用滅菌的棉拭子沾取新鮮宰殺雞血液和活魚體表，拭子樣本分別涂布接種于TSA平板，37℃培養(yǎng)24 h，于實體顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。根據(jù)菌落的形態(tài)特征分別挑選單個菌落接種于TSA平板進行純培養(yǎng)。

1.3 抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選 以C.fimi作為指示菌，參照文獻[9]采用延遲拮抗試驗法檢測分離菌株是否產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，通過測量菌落周圍產(chǎn)生的抑菌圈大小來判斷生物活性物質(zhì)產(chǎn)生的強弱，每一試驗至少重復3次。

1.4 抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌對幾種動物病原菌的抑制檢測 在TSA固體培養(yǎng)基上分別均勻涂布接種SS9、Ⅳ型胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和紅斑丹毒絲菌，接種環(huán)沾取固體培養(yǎng)基上抑菌的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌新鮮培養(yǎng)物分別點接種于各培養(yǎng)平板，參照文獻[2]，采用同時拮抗試驗法檢測抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌對不同動物病原菌的抑制作用。

1.5 抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的鑒定 挑選對指示菌抑殺作用極顯著且對病原菌有抑殺作用的產(chǎn)生菌，觀察菌落形態(tài)結構，革蘭氏染色后進行菌體形態(tài)學觀察。參照《伯杰氏細菌學分類鑒定手冊》進行生化試驗。參照文獻[10]進行16S rDNA序列鑒定并測序。

1.6 蛋白酶和NaOH對活性物質(zhì)的影響 參照文獻[9]方法，檢測鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和0.2 mol/L NaOH對抗菌活性物質(zhì)活力的影響。

1.7 細菌培養(yǎng)上清液中細菌素的初提及活性分析將活性物質(zhì)產(chǎn)生菌接種TSB培養(yǎng)液中，37℃128 r/min培養(yǎng)24 h。參照文獻[11-12]，采用氯仿抽提法對培養(yǎng)上清液的抑菌活性物質(zhì)進行初提。參照文獻[13]，采用瓊脂擴散法測定初提物活力，細菌素活力用AU(Arbitrary units)/mL表示，定義為測試樣品對指示菌生長表現(xiàn)出清晰抑制作用最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)，乘以細菌素單位體積(1 mL)與測試使用體積之比。

1.8 溫度和pH對細菌素初提物的影響 將細菌素初提物在65℃、80℃、100℃和121℃分別處理15 min，檢測細菌素初提物對溫度的敏感性。同時將初提物各樣本pH分別調(diào)至pH3.0、pH9.0和pH11.0，室溫條件下感作4 h后，將樣本pH調(diào)回至對照pH值，所有試驗均用未經(jīng)處理的細菌素初提物作為對照。采用瓊脂擴散法測定處理前后樣品的活性。

1.9 細菌素結構基因的PCR鑒定 設計雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)細菌素(即雞皮素，gallidermin)特異性結構基因gdmH(ATP結合轉(zhuǎn)運蛋白輔助因子編碼基因)引物：(gdmF：5'-GAGCCTTGG TTTATCTTTGTTG-3'/gdmR：5'-TCTTTCGTCTTTAC CTTGTCCTC-3')，產(chǎn)物大小352 bp；利用文獻[14]中表皮葡萄球菌產(chǎn)生的表皮素(Epidermin)特異性結構基因eipH的引物，參照文獻[9]，提取細菌素產(chǎn)生菌細胞總DNA，以此為模板，利用上述兩對引物分別進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司廣州分部測序。

2 結果

2.1 抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選及活性物質(zhì)對常見動物病原菌的抑制作用 通過延遲拮抗試驗法，從純化的細菌菌株中篩選得到48株對指示菌C.fimiNCTC7547株表現(xiàn)出抑制活性的菌株，檢測結果顯示抑菌圈直徑為6 mm～50 mm，其中有2株抑菌圈直徑≥40 mm，均分離自雞身上的毛屑樣本，編號分別為JC1和JC2。對6種常見動物細菌性病原菌的抑制試驗結果顯示，JC1和JC2對紅斑丹毒絲菌抑菌圈直徑為9 mm～10 mm，JC2對SS9抑菌圈直徑達10.70 mm。表明這兩株菌具有較強的抑菌活性。

2.2 活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的鑒定 對JC1和JC2分別進行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色觀察、生理生化鑒定及16S rDNA序列鑒定。結果顯示：JC1和JC2為黃色菌落，菌落邊緣顏色較中間部分深，菌落不透明、表面干燥，呈擴散生長，邊緣呈分枝狀或鋸齒狀。革蘭染色均為陽性，小球菌，多為單個存在。2個菌株的生化試驗結果見表1。

表1 菌株JC1和JC2的生化特性Table 1 Biochemical properties of isolate JC1 and JC2

生化結果顯示，JC1和JC2 2個菌株與雞葡萄球菌的生化特性相符，且形態(tài)特征也與《伯杰氏細菌學分類鑒定手冊》中描述的雞葡萄球菌的形態(tài)特征一致。此外，對JC1和JC2的16S rDNA擴增、測序和比對分析表明，JC1和JC2與雞葡萄球菌的相似性高達100 %，進一步確定兩株菌株為雞葡萄球菌。

2.3 固體培養(yǎng)基上蛋白酶和NaOH對活性物質(zhì)的影響 采用延遲拮抗試驗檢測蛋白酶和NaOH對JC1和JC2產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)影響，結果顯示2株菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)均能抵抗0.2 mol/L NaOH、蛋白酶K和胰蛋白酶的作用，作用前后抑菌圈大小無變化；對鏈霉蛋白酶的作用敏感，作用后抑菌圈基本消失。對NaOH的抵抗作用表明活性物質(zhì)的抑菌作用不是由細菌代謝產(chǎn)生的有機酸導致的，對鏈霉蛋白酶敏感表明了兩種活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)屬性(圖1)。綜上所述，表明該2株雞葡萄球菌菌株產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)很可能是一種細菌素樣物質(zhì)[15]。

圖1 固體培養(yǎng)基上3種蛋白酶和NaOH對JC1和JC2產(chǎn)生的活性物質(zhì)的影響Fig.1 Effects of three enzymes and 0.2M NaOH on inhibition of isolate JC1 and JC2 on solid media

2.4 細菌素初提物的活性分析2株細菌培養(yǎng)上清初提物活性檢測結果顯示JC1和JC2對指示菌有明顯抑制作用的最高稀釋度分別為1∶256和1∶1 024，計算得到JC1和JC2細菌素初提物活力分別為5 120 AU/mL和20 480 AU/mL，初提的后細菌素活力均為未提上清原液活力的64倍(JC1未抽提上清細菌素活力為80 AU/mL，JC2為320 AU/mL)。表明氯仿抽提法適用于該類抗菌活性物質(zhì)的抽提，且是一種相對簡單的提取方法。

2.5 溫度和pH對細菌素初提物的影響 溫度試驗結果顯示，JC1和JC2細菌素初提物可抵抗65℃、80℃、100℃和pH3.0、pH9.0作用，作用前后抑菌圈大小無顯著變化，活力未降低。但pH11.0作用使JC2初提物活力下降到320 AU/mL，而JC1無變化。121℃、15 min處理使JC1和JC2初提物活性分別下降至20 AU/mL和100 AU/mL(圖2)。JC1和JC2細菌素初提物對熱穩(wěn)定性表明它們可能屬于Ⅰ類細菌素羊毛硫細菌素類[2]。

圖2 熱處理和不同pH對JC1和JC2初提物活性的影響Fig.2 Effects of temperature and different pH on partial purifications of isolate JC1 and JC2

2.6 細菌素結構基因的PCR檢測 以抽提的2株產(chǎn)生細菌素的菌株總DNA為模板，利用雞皮素和表皮素結構基因gdmH和eipH特異性引物分別進行擴增。結果顯示，2株菌用雞葡萄球菌素結構基因gdmH特異性引物均能擴增得到與預期片段大小一致的DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序、編緝后獲得有效序列長度分別為353 bp和352 bp(圖3)，BLAST在線比對分析顯示，JC1和JC2有效片段與數(shù)據(jù)庫中雞皮素結構基因相似度分別達99 %和100 %，與表皮素結構基因相似度均為83 %；而以表皮素結構基因epiH特異性引物來擴增到目的條帶。表明JC1和JC2產(chǎn)生的細菌素可能為雞皮素。

圖3 JC1和JC2細菌素結構基因的PCR檢測Fig.3 Detection of structural genes of bacteriocins from isolate JC1 and JC2 by PCR

3 討論

本研究從環(huán)境和動物體表取樣，篩選到對指示菌C.fimiNCTC7543株有抑殺作用的菌株48株，其中2株對指示菌C.fimi的抑菌圈直徑≥40 mm，編號分別為JC1和JC2。經(jīng)生化鑒定和分子生物學鑒定，確定JC1和JC2為雞葡萄球菌。通過對的細菌素結構基因的PCR檢測和序列分析，表明了JC1和JC2產(chǎn)生的活性物質(zhì)極有可能是雞皮素。自Kellner等在1988年從雞葡萄球菌(F16/P57)Tü3928菌株分離到雞皮素以來[16]，不少研究者對雞皮素和表皮素的結構基因、分泌特性、生物合成等進行了報道，證實雞皮素是表皮素的天然變異體[2]。本研究選用的3種蛋白酶具有較廣譜活性，鏈霉蛋白酶水解谷氨酸或天冬氨酸羧基端的肽鍵，胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，專門切割多肽鏈中賴氨酸或精氨酸殘基中的羧基端肽鍵，蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶。Kellner[16]等和Allgaier[17]等對表皮素和雞皮素結構研究顯示，兩種細菌素均存在胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶的切割位點，且研究中均選用胰蛋白酶作為消化酶。本研究中2個菌株產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對鏈霉蛋白酶敏感，與Allgaier等研究證實的鏈霉蛋白酶可成功裂解表皮素相符；但活性物質(zhì)對胰蛋白酶不敏感，與Kellner等和Allgaier等研究結果不同，可能是JC1和JC2產(chǎn)生的細菌素在蛋白質(zhì)結構上還有別于表皮素和Kellner等分離的雞皮素。因此，有必要對JC1和JC2產(chǎn)生的細菌素進行純化，并對蛋白質(zhì)序列進行深入研究。實驗中采用氯仿抽提法對JC1和JC2無細胞培養(yǎng)上清進行抽提，抽提后細菌素活力提高64倍，表明氯仿抽提法是該類細菌素抽提的適宜方法。

目前，具有潛在毒性化學成分的食品保藏方法越來越受到消費者的質(zhì)疑，被認為是天然活性物質(zhì)的細菌素的發(fā)現(xiàn)以及對細菌素應用方法的發(fā)展，使細菌素在食品保鮮上的應用成為可能。JC1和JC2初提物對熱穩(wěn)定和對低pH處理均能保持各自活力不變，提示雞皮素具有應用于酸性食品防腐的潛能，但需要對引起食物腐敗和食物中毒微生物的抑殺作用做進一步的研究。pH11.0作用使JC2初提物活力下降到320 AU/mL，僅為處理前初提物活力的1.6 %，表明JC2產(chǎn)生的雞皮素在pH11.0條件下活性不穩(wěn)定，與Allgaier等研究發(fā)現(xiàn)表皮素在高堿性條件下活力不穩(wěn)定的結果一致[17]。JC1初提物活力在pH11.0作用后活力不變，兩種雞皮素對堿特性的差異可能是其蛋白質(zhì)結構的不同造成的。2個菌株產(chǎn)生的雞皮素對6種常見動物細菌性病原菌的抑制實驗顯示，JC1和JC2對紅斑丹毒絲菌均有抑制作用，JC2還對SS9和變形桿菌有抑制，表明它們在防治某些特定細菌性疾病方面有潛在應用的可能。