王明曉，余子豪，劉金澤，李統(tǒng)戰(zhàn)，張遠(yuǎn)星，余旭平

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058)

編碼細(xì)菌鞭毛的基因簇位于細(xì)菌基因組的4個(gè)不同位置，包含50多個(gè)基因，至少由14個(gè)操縱子組成[1]。細(xì)菌鞭毛基因簇的表達(dá)呈現(xiàn)Ⅲ級階梯(Three classes hierarchical order)[1-3]。研究表明，鞭毛表達(dá)的主調(diào)控基因flhDC(Flagellar master regulatory genes flhDC)控制其下游鞭毛基因的表達(dá)，調(diào)控表達(dá)強(qiáng)度，最終決定細(xì)菌表面的鞭毛長度、數(shù)量和運(yùn)動力。flhDC主調(diào)控基因又受多種環(huán)境因子的調(diào)控，包括：環(huán)境溫度、pH值、滲透壓、氧氣等[4]，使細(xì)菌更適應(yīng)環(huán)境條件的變化，以逃離不利環(huán)境，獲得更好的營養(yǎng)與生存條件。

大多數(shù)沙門氏菌有鞭毛，具有運(yùn)動力，雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum，SP)和雞傷寒沙門氏菌(Salmonella gallinarum，SG)除外。但Chaubal和Holt曾報(bào)道，SP在特定情況下存在鞭毛活性[5-6]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中探索SP的動力特性，將鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，STM)542菌株的flhDC基因克隆于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入SP527和STM542中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)flhDC基因正向轉(zhuǎn)化子不容易篩選到，或即使篩選到相應(yīng)克隆也不易轉(zhuǎn)化入SP527和STM542中，推測克隆于pMD18-T載體中的flhDC基因由于lac啟動子的漏表達(dá)，細(xì)胞中FlhD4C2的含量超過了細(xì)菌的耐受量，影響了細(xì)菌的正常生存，可能致死細(xì)菌。為了驗(yàn)證沙門氏菌flhDC基因過表達(dá)是否致死宿主菌，本實(shí)驗(yàn)研究了flhDC基因在超強(qiáng)調(diào)控能力的表達(dá)載體pN15E6中的克隆和過表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑NcoⅠ酶、BglⅡ酶、T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；DL2000 Marker、DL5000 Marker、TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌質(zhì)粒快速提取試劑盒和PCR清潔試劑盒、基因組快速抽提試劑盒均購自Axygen公司；IPTG和阿拉伯糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 質(zhì)粒與菌株STM 542菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；E.coliDH31soplacI菌株、pN15E6質(zhì)粒由俄羅斯科學(xué)家Ravin NV[7]團(tuán)隊(duì)惠贈；E.coliJM109菌株、pBAD33質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；pKDb質(zhì)粒、pBAD-flhDC重組質(zhì)粒[8]由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存。

1.3 目的基因的擴(kuò)增及flhD、flhC同源性比較 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取STM542菌株基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增STM的flhDC及flhD、flhC基因片段。擴(kuò)增所用引物及特性見表1，引物合成及PCR產(chǎn)物的測序由華大生物科技有限公司完成。

表1 目的基因及擴(kuò)增引物Table 1 The primers for amplification of target genes

參照GenBank中5株腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)基因組序列：S.typhimuriumLT2、S.gallinarum287/91、傷寒沙門氏菌(S.typhi)CT18、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)B67、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)P125109；以及3株大腸桿菌(Escherichiacoli)基因組序列：MG1655、W3110、DH10B，分別比對5株沙門氏菌、3株大腸桿菌flhD、flhC推導(dǎo)氨基酸序列，計(jì)算其同源性。

1.4 含不同鞭毛基因的pN15E6重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用NcoⅠ/BglⅡ雙酶切處理PCR目的基因片段和pN15E6質(zhì)粒，將目的基因分別克隆于pN15E6中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC。以pN15-insChKUp3/pN15-insChKDn2為引物(表1)，PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 pKDb-flhD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以pN15E6-flhD重組質(zhì)粒為模板，以Trrn_up1/T0_dn1為引物，PCR擴(kuò)增flhD表達(dá)盒，克隆于經(jīng)XcmⅠ酶切pKDb質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體pKDb-flhD。以pKDb_SeqR/pKDb_SeqF為引物，PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.6 鞭毛基因在大腸桿菌DH31soplacI、JM109中的過表達(dá)對菌株存活的影響 將含不同鞭毛基因的重組質(zhì)粒(pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC)轉(zhuǎn)化DH31soplacI、JM109菌株，選取單克隆過夜培養(yǎng)，取無菌LB培養(yǎng)基106倍稀釋過夜培養(yǎng)物，涂布于卡那氯霉素雙抗性(或卡那抗性)LB瓊脂平板和含0.4 mM IPTG的卡那氯霉素雙抗性(或卡那抗性)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.7 含pBAD-flhDC質(zhì)粒的大腸桿菌JM109菌株動力試驗(yàn)的測定 分別將pBAD33、pBAD-flhDC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109菌株后，分別取2μL含pBAD33、pBAD-flhDC質(zhì)粒的大腸桿菌JM109菌株的過夜培養(yǎng)物，點(diǎn)種于含不同濃度阿拉伯糖(0、0.005 %、0.025 %、0.125 %、0.5 %、1 %)的運(yùn)動瓊脂平板(不含相應(yīng)的抗生素)，37℃培養(yǎng)6 h～7 h后，通過測量半固體平板上菌落的直徑，評估沙門氏菌flhDC基因表達(dá)對大腸桿菌宿主菌生長、動力的影響。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及flhD、flhC同源性比較 以STM542基因組為模板利用表1所示引物，PCR擴(kuò)增獲得基因片段大小分別為973 bp、579 bp、351 bp(圖1)，經(jīng)測序鑒定表明，分別為flhDC、flhC和flhD基因。

通過比對5株沙門氏菌、3株大腸桿菌flhD、flhC基因推導(dǎo)氨基酸序列，結(jié)果顯示，5株腸炎沙門氏菌flhD的推導(dǎo)氨基酸序列完全相同，flhC的推導(dǎo)氨基酸同源性為98.96 %～99.83 %。3株大腸桿菌flhD、flhC的推導(dǎo)氨基酸同源性均在97 %以上。而沙門氏菌與大腸桿菌之間的flhD、flhC的推導(dǎo)氨基酸差異大一些，同源性分別為74.34 %～75.78 %，76.51 %～81.69 %。結(jié)果表明flhDC基因在沙門氏菌與大腸桿菌之間存在差異，需進(jìn)一步驗(yàn)證沙門氏菌flhDC基因在大腸桿菌宿主菌中的調(diào)控功能。

圖1 目的基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of target genes by PCR

2.2 含不同鞭毛基因的pN15E6重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 以pN15-insChKUp3/pN15-insChKDn2為引物(表1)，PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC。結(jié)果顯示pN15E6-flhD、pN15E6-flhC、pN15E6-flhDC重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。

2.3 pKDb-flhD重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 以pKDb_SeqR/pKDb_SeqF為引物，PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pKDb-flhD。結(jié)果顯示pKDb-flhD重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4 鞭毛主調(diào)控基因flhDC過表達(dá)致死大腸桿菌宿主 將重組質(zhì)粒pN15E6-flhDC轉(zhuǎn)化DH31soplacI、JM109菌株后涂板培養(yǎng)，結(jié)果顯示卡那氯霉素(或卡那)平板上有大量細(xì)菌生長，而對應(yīng)含誘導(dǎo)劑的平板上無細(xì)菌生長(圖2)，表明flhDC基因過表達(dá)能夠致死大腸桿菌宿主菌。

圖2 鞭毛基因flhDC過表達(dá)致死大腸桿菌宿主菌菌株的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The overexpression of flagellar flhDC genes killed E.coli host strains

2.5flhD、flhC基因單獨(dú)過表達(dá)不致死大腸桿菌宿主菌 將重組質(zhì)粒pN15E6-flhD和pN15E6-flhC分別轉(zhuǎn)化DH31soplacI、JM109菌株進(jìn)行基因過表達(dá)試驗(yàn)，結(jié)果顯示flhD和flhC單獨(dú)過表達(dá)均不致死大腸桿菌宿主菌(圖3)。結(jié)合結(jié)果2.2，表明flhDC基因過表達(dá)致死大腸桿菌宿主菌是由flhD和flhC兩個(gè)基因共同表達(dá)(應(yīng)該組合成FlhD4C2鞭毛主調(diào)控蛋白)引起的，而不是其中任何之一單獨(dú)過表達(dá)的結(jié)果。

2.6 同一細(xì)胞中分別過表達(dá)flhD和flhC兩個(gè)基因致死宿主菌 將重組質(zhì)粒pKDb-flhD和pN15E6-flhC同時(shí)轉(zhuǎn)化DH31soplacI、JM109菌株進(jìn)行基因過表達(dá)試驗(yàn)，與flhDC雙基因過表達(dá)致死宿主菌的結(jié)果一致，在同一細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)flhD和flhC也致死宿主菌。進(jìn)一步證明了flhDC基因過表達(dá)致死大腸桿菌DH31soplacI和JM109是由flhD和flhC兩個(gè)基因同時(shí)表達(dá)，并組合成了FlhD4C2鞭毛主調(diào)控蛋白所致，而不是其中任何之一單獨(dú)過表達(dá)的結(jié)果。

2.7 含pBAD-flhDC質(zhì)粒的重組大腸桿菌的動力試驗(yàn) 對含有pBAD33、pBAD-flhDC質(zhì)粒的大腸桿菌JM109菌株進(jìn)行動力試驗(yàn)測定，結(jié)果顯示，與對照pBAD33相比，隨著阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度的提高，含沙門氏菌flhDC基因的重組菌株的動力不斷增強(qiáng)，在阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度為0.5 %的時(shí)候直徑最大，隨后在阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度為1 %的時(shí)候，動力開始下降。表明沙門氏菌flhDC基因在低濃度阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)大腸桿菌鞭毛動力，類似于大腸桿菌自身flhDC基因的活性。其中一次的動力試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 含pBAD-flhDC質(zhì)粒的大腸桿菌JM109菌株動力試驗(yàn)的測定結(jié)果Fig.4 The motility assay of E.coli JM109 contain plasmid pBAD or pBAD-flhDC

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌flhDC基因過表達(dá)可以致死大腸桿菌宿主菌，并且結(jié)果顯示只有flhD和flhC兩個(gè)基因同時(shí)過表達(dá)才可以致死宿主菌，而單一基因過表達(dá)不會致死宿主菌。雖未見類似的過表達(dá)致死報(bào)道，但有研究結(jié)果顯示，奇異變形桿菌flhDC表達(dá)量上升時(shí)，細(xì)菌出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象；而當(dāng)flhDC表達(dá)量降低時(shí)，細(xì)菌又恢復(fù)到正常的生長狀態(tài)[9]。表明，flhDC基因的表達(dá)量達(dá)到一定值時(shí)，細(xì)菌的生長受到抑制，而進(jìn)一步過量表達(dá)時(shí)則致死細(xì)菌。

本研究通過比對flhD、flhC基因編碼的氨基酸，發(fā)現(xiàn)其在沙門氏菌和大腸桿菌之間存在一定的差異。為探究沙門氏菌flhDC基因在大腸桿菌中的活性，本研究進(jìn)行了flhDC重組菌的動力試驗(yàn)，結(jié)果顯示，沙門氏菌flhDC基因在低濃度誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，具有促進(jìn)大腸桿菌鞭毛動力的活性。且有研究報(bào)道，STM鞭毛基因fliC在大腸桿菌中可以表達(dá)并組裝成鞭毛絲，也具有動力學(xué)特性[10]。表明，沙門氏菌的鞭毛基因，在大腸桿菌中也可正常表達(dá)，同樣具有鞭毛活性。

細(xì)菌鞭毛基因的表達(dá)呈Ⅲ級調(diào)控，flhDC基因是Ⅰ級主調(diào)控因子，可開啟Ⅱ級基因的表達(dá)和基體-鞭毛鉤的組裝，同時(shí)激活Ⅲ級基因表達(dá)所需的fliA基因的表達(dá)。此外，有研究表明flhDC基因除調(diào)控鞭毛基因的表達(dá)外，還參與調(diào)控mreB等非鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[11-12]，而mreB基因產(chǎn)物參與細(xì)菌生長與分裂。本研究結(jié)果顯示的flhDC基因過表達(dá)致死宿主菌的現(xiàn)象，是否有可能通過調(diào)控mreB基因的過表達(dá)而實(shí)現(xiàn)；以及該現(xiàn)象是否是flhDC基因表達(dá)產(chǎn)物FlhD4C2首先通過調(diào)控宿主菌鞭毛的Ⅲ級表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步通過被調(diào)控的鞭毛基因的表達(dá)產(chǎn)物，調(diào)控了鞭毛外與致死相關(guān)基因的結(jié)果；或者是FlhD4C2直接調(diào)控了鞭毛外與致死相關(guān)的基因，最終表現(xiàn)細(xì)菌死亡。有關(guān)其它鞭毛基因和鞭毛外基因過表達(dá)致死宿主菌的試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行中。

殺死或抑制細(xì)菌生長是人類控制細(xì)菌性疾病的主要策略，但隨著抗菌藥物的廣泛使用，特別是大量濫用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，因此急需尋找新型藥物來控制細(xì)菌性疾病。本研究首次發(fā)現(xiàn)的flhDC基因過表達(dá)致死宿主菌的現(xiàn)象，以及通過對其機(jī)理的進(jìn)一步深入研究，將有望發(fā)現(xiàn)一批與致死宿主細(xì)菌相關(guān)的基因，為新型藥物的研發(fā)提供一系列新的靶點(diǎn)，為解決細(xì)菌耐藥性問題提供新的方向。