金 鑫，張 曼，王云鶴，魏 方，溫婧怡，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018)

隨著抗生素在人類(lèi)和動(dòng)物中的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康和生態(tài)系統(tǒng)安全。因此，研制可取代抗生素且無(wú)藥物殘留的抗菌肽成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

目前，對(duì)人和動(dòng)物體內(nèi)研究較多的抗菌肽分子是防御素，防御素作為內(nèi)源性抗菌肽家族中最大的亞家族，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，然而防御素在機(jī)體內(nèi)表達(dá)甚微，天然獲取的量非常有限，且提取工藝復(fù)雜，成本高昂，因此對(duì)內(nèi)源性抗菌肽防御素的研究尚難以進(jìn)入規(guī)模化生產(chǎn)的進(jìn)程。但防御素具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)，尋求安全、有效的誘導(dǎo)劑，特異性誘導(dǎo)其在某些器官的關(guān)鍵部位高效表達(dá)，從而在機(jī)體局部起到殺滅病原微生物的作用，為解決上述問(wèn)題提供了一個(gè)好辦法。

酵母菌作為反芻動(dòng)物飼用抗生素的重要替代物，其在反芻動(dòng)物體內(nèi)除起到促生長(zhǎng)的作用外，還起到一定的免疫作用[1]。如今釀酒酵母菌作為重要的綠色無(wú)污染益生菌制劑已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，研究表明益生菌主要通過(guò)其細(xì)胞壁成份影響宿主免疫系統(tǒng)[2]，釀酒酵母菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖和甘露聚糖兩類(lèi)多糖組成。葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠有效增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的先天性免疫反應(yīng)[3-5]；同時(shí)也能夠上調(diào)其體內(nèi)的抗菌肽β-防御素和cathelicidin的表達(dá)[6-8]。而甘露聚糖作為免疫功能最強(qiáng)的酵母細(xì)胞壁多糖[9]，能夠增加動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫能力，并對(duì)改善宿主腸道內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和誘導(dǎo)宿主腸道免疫反應(yīng)有著十分重要的作用[10]。但關(guān)于甘露聚糖與反芻動(dòng)物抗菌肽表達(dá)的關(guān)系研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，僅見(jiàn)白色念珠菌細(xì)胞壁提取物甘露聚糖可以促使人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)β-防御素-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)[11]。

因此，本研究在確定釀酒酵母菌能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(Ruminal Epithelial Cells，RECs)β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1，SBD-1)表達(dá)量增多的基礎(chǔ)上[12]，進(jìn)一步采用熒光定量PCR(qPCR)和ELISA試驗(yàn)研究其細(xì)胞壁成分甘露聚糖對(duì)SBD-1表達(dá)的調(diào)控規(guī)律，從益生性釀酒酵母菌的細(xì)胞壁成分甘露聚糖誘導(dǎo)綿羊RECs SBD表達(dá)的新角度解析甘露聚糖在體內(nèi)如何發(fā)揮益生作用，為更好的開(kāi)發(fā)利用甘露聚糖制劑提供實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑RECs由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)純化和鑒定后凍存保留；提取自釀酒酵母菌的甘露聚糖(M7504-100MG)購(gòu)自Sigma公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和qPCR酶(RR820A)購(gòu)自TaKaRa公司；綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒(ELA06599Sh)購(gòu)自武漢新啟迪生物公司。

1.2 引 物 根據(jù)GenBank中的β-Actin內(nèi)參基因(U39357)和SBD-1基因序列(U75250)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物(β-actin F：GTCACCAACTGGGAC GACA/R：AGGCGTACAGGGACAGCA；SBD-1 F：GCTCTTCTTCGTGGTCCTGT/R：ACAGGTGCCAAT CTGTCTCA)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為208 bp和133 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 RECs的培養(yǎng) 將凍存的RECs在37℃水浴鍋中迅速?gòu)?fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng)，然后調(diào)整細(xì)胞濃度分別傳于6孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)孔底壁的90 %以上時(shí)，用無(wú)血清、無(wú)抗生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h的饑餓處理(為了使細(xì)胞在給予刺激前不進(jìn)行分裂增殖，處于同一細(xì)胞周期)。饑餓處理后用無(wú)雙抗的PBS洗滌3次，然后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于后續(xù)的細(xì)胞刺激和活性鑒定試驗(yàn)。

1.4 不同濃度甘露聚糖對(duì)RECs的刺激 將各培養(yǎng)板的RECs分為對(duì)照組和刺激組，對(duì)照組不用甘露聚糖刺激，而刺激組為不同濃度(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)甘露聚糖對(duì)RECs的刺激，各組細(xì)胞刺激8 h后：6孔板內(nèi)的細(xì)胞采用Axygen的總RNA提取試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作得到總RNA，并用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的純度和濃度。同時(shí)將提取的總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用已設(shè)計(jì)引物，利用qPCR檢測(cè)SBD-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premin ExTaq(2×)10μL，上游引物(10μmol/L)0.8μL，下游引物(10μmol/L)0.8μL，cDNA模板2μL，dH2O 6.4μL。反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增程序：95℃30 s；95℃5 s、60℃34 s，45個(gè)循環(huán)；溶解程序：95℃5 s；60℃30 s；95℃15 s，每個(gè)樣品的SBD-1基因和β-actin基因分別做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，用2-ΔΔCt法[15]計(jì)算SBD-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清采用DEFβ1 ELISA試劑盒進(jìn)行SBD-1蛋白檢測(cè)，按其說(shuō)明書(shū)操作后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和各樣品OD450nm值，利用EXCEL軟件分別以標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到二次多項(xiàng)式方程，根據(jù)該方程和各樣品的OD450nm值計(jì)算SBD-1蛋白表達(dá)量。

對(duì)96孔板內(nèi)的RECs采用常規(guī)MTT法檢測(cè)不同濃度甘露聚糖刺激RECs 8 h后對(duì)RECs活力的影響。

1.5 甘露聚糖對(duì)RECs不同時(shí)間的刺激 同樣將各培養(yǎng)板的細(xì)胞分為對(duì)照組和刺激組，對(duì)照組不用甘露聚糖刺激，而刺激組為誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)最高濃度的甘露聚糖(即試驗(yàn)1.4結(jié)果)對(duì)RECs不同時(shí)間(2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)的刺激，按照1.4的方法分別進(jìn)行qPCR和ELISA試驗(yàn)，以檢測(cè)不同刺激時(shí)間RECs中SBD-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量；而96孔板內(nèi)的細(xì)胞同樣采用常規(guī)MTT法檢測(cè)甘露聚糖刺激RECs不同時(shí)間后對(duì)RECs活力的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)在同一批次細(xì)胞內(nèi)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯氏法(Duncan)多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p＜0.01和p＜0.05分別為差異極顯著和差異顯著，采用GraphPad Prism軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 RECs培養(yǎng)結(jié)果 傳代的RECs生長(zhǎng)迅速，4 d后細(xì)胞即有90 %以上聚集生長(zhǎng)，呈漩渦狀的致密單層細(xì)胞集落，且細(xì)胞界限較為清晰，胞漿呈顆粒狀，核圓而大(圖略)，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其二次多項(xiàng)式擬合方程為y=ax2+bx+c(其中a=77.928，b=104.24，c=3.4885)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974，表明樣品SBD-1蛋白表達(dá)量可以利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

圖1 ELISA試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ELISA test

2.3 不同濃度甘露聚糖對(duì)RECs SBD-1表達(dá)的影響 利用qPCR和ELISA對(duì)不同濃度甘露聚糖刺激RECs 8 h后其SBD-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。qPCR結(jié)果顯示：用不同濃度的甘露聚糖刺激RECs 8 h后，其均能誘導(dǎo)SBD-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平增加，且與對(duì)照組相比均呈極顯著性差異(p＜0.01)。隨著甘露聚糖濃度的增加，SBD-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)甘露聚糖的刺激濃度為50μg/mL時(shí)SBD-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大，之后有所下降，但SBD-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在甘露聚糖刺激濃度為50μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL、400μg/mL時(shí)互相呈不顯著性差異(p＞0.05)(圖2A)；ELISA結(jié)果顯示：SBD-1蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)基本一致，不同濃度的甘露聚糖刺激RECs后SBD-1的蛋白表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，當(dāng)甘露聚糖的刺激濃度為50μg/mL時(shí)SBD-1蛋白表達(dá)量達(dá)到最大(圖2B)。同時(shí)MTT結(jié)果顯示：不同濃度的甘露聚糖刺激RECs 8 h后與未刺激組相比差異均不顯著(p＞0.05)，表明刺激后的RECs均能夠存活，其活力不受甘露聚糖刺激的影響(圖2C)。因此，不同濃度的甘露聚糖均可以誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)，但刺激濃度為50μg/mL時(shí)SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最大。

圖2 不同濃度甘露聚糖對(duì)RECs SBD-1表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of mannan on RECs SBD-1 expression

2.4 甘露聚糖刺激RECs不同時(shí)間后對(duì)SBD-1表達(dá)的影響 選用誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)最高濃度的甘露聚糖(50μg/mL)刺激RECs不同時(shí)間后，利用qPCR和ELISA對(duì)SBD-1的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。qPCR結(jié)果顯示：甘露聚糖對(duì)RECs不同時(shí)間的刺激均可以誘導(dǎo)SBD-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增加，且與對(duì)照組相比均呈極顯著性差異(p＜0.01)。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈先升高后降低趨勢(shì)，刺激時(shí)間為4 h時(shí)SBD-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值，且極顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，并與其它時(shí)間刺激組(2 h、8 h、12 h、24 h)相比呈顯著性 差 異(p＜0.05)(圖3A)；ELISA結(jié)果同樣顯示：SBD-1的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比呈極顯著性差異(p＜0.01)，且刺激時(shí)間為4 h時(shí)SBD-1蛋白表達(dá)量達(dá)到最大(圖3B)。同時(shí)MTT結(jié)果顯示：50μg/mL的甘露聚糖刺激RECs不同時(shí)間后與未刺激組相比差異不顯著(p＞0.05)，表明RECs的活力不受甘露聚糖刺激的影響(圖3C)。因此，濃度為50μg/mL的甘露聚糖刺激RECs 4 h時(shí)，SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高。

圖3 甘露聚糖刺激RECs不同時(shí)間后對(duì)SBD-1表達(dá)的影響Fig.3 Effects of mannan stimulates different times on RECs SBD-1 expression

3 討論

防御素是機(jī)體自身內(nèi)源性抗菌肽，具有重要的抗感染功能。利用抗菌肽防御素作為藥物防治胃腸道疾病已成為學(xué)者們關(guān)注的一個(gè)新方向。而來(lái)源于白色念珠菌細(xì)胞壁成分的甘露聚糖已被證明可以誘導(dǎo)人體內(nèi)防御素的表達(dá)[11]，但酵母菌作為畜牧業(yè)生產(chǎn)中常用的飼料添加劑，有關(guān)其細(xì)胞壁成分甘露聚糖對(duì)防御素表達(dá)影響的研究較少，因此本研究構(gòu)建以益生性釀酒酵母菌細(xì)胞壁成分甘露聚糖誘導(dǎo)綿羊RECs SBD-1表達(dá)的模型，探究釀酒酵母菌細(xì)胞壁成分甘露聚糖調(diào)節(jié)防御素表達(dá)的規(guī)律。

隨著益生菌和防御素表達(dá)關(guān)系的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)揮益生作用多數(shù)是靠其具有良好免疫原性的細(xì)胞壁成分發(fā)揮重要的抗感染作用。機(jī)體通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，快速釋放抗菌物質(zhì)和協(xié)同刺激分子，構(gòu)成抵御病原微生物入侵的第一道防線，同時(shí)啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)發(fā)揮防御作用[13]。甘露聚糖作為PAMPs的重要一員，且作為益生性釀酒酵母菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠誘導(dǎo)綿羊RECs SBD-1的表達(dá)量增加，表明甘露聚糖在動(dòng)物體內(nèi)增加先天性免疫的能力可能部分是通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)防御素的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。生理狀態(tài)下，SBD-1在綿羊的胃腸道中均有不同程度的表達(dá)，但以瘤胃組織表達(dá)水平較高[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，用甘露聚糖刺激綿羊RECs后SBD-1表達(dá)量升高，且與甘露聚糖濃度和刺激時(shí)間存在相關(guān)性，表明適當(dāng)濃度的甘露聚糖和刺激時(shí)間可以特異性誘導(dǎo)防御素在某些器官的高效表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)從mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平對(duì)釀酒酵母菌細(xì)胞壁主要成分甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的最佳濃度和刺激時(shí)間進(jìn)行了探究。不同濃度的甘露聚糖對(duì)RECs SBD-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。MTT的結(jié)果表明不同濃度的甘露聚糖對(duì)RECs的活性并沒(méi)有影響，這些結(jié)果表明SBD-1表達(dá)量的下降并不是由于甘露聚糖濃度的增大而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡引起的，而可能是由于RECs中能夠識(shí)別甘露聚糖的膜受體有限，因此SBD-1的表達(dá)量并不是隨著甘露聚糖的濃度增大而增多；隨后選用誘導(dǎo)效果最好的甘露聚糖(濃度為50μg/mL)分別刺激RECs不同時(shí)間后，SBD-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)量在甘露聚糖刺激RECs 4 h時(shí)達(dá)到最大，之后呈下降趨勢(shì)。而MTT細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示甘露聚糖刺激RECs不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞活性并無(wú)影響，推測(cè)甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)可能也是機(jī)體自身的一種調(diào)節(jié)過(guò)程：即當(dāng)SBD-1的表達(dá)量被甘露聚糖誘導(dǎo)達(dá)到峰值時(shí)，機(jī)體也會(huì)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸將SBD-1的表達(dá)量調(diào)節(jié)到自身水平，從而維持SBD-1的動(dòng)態(tài)平衡，但其具體的調(diào)節(jié)過(guò)程以及甘露聚糖能否在綿羊體內(nèi)誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。