姚佳，朱莉，郭鑫，徐鵬飛，江沛，崔昌萌

1.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧市272000；2.華北理工大學(xué)，河北唐山市063000；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)寧市272000

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)是神經(jīng)外科高發(fā)疾病之一，容易發(fā)生在中青年人群中，也是致殘率、死亡率較高的疾病[1]。TBI引起的不良后果，如腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙等，是由于原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷共同所致[2-3]，所以了解TBI的進(jìn)展過(guò)程，預(yù)防或減輕繼發(fā)性腦損傷，是減少患者死亡率和改善生活質(zhì)量的有力保證。目前針對(duì)腦損傷所致神經(jīng)元死亡的研究大多集中在細(xì)胞凋亡方面，其凋亡通路及發(fā)生過(guò)程已較為明確[4-5]。

近年來(lái)，自噬引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[6-7]。有研究表明，微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)參與自噬延長(zhǎng)階段[8]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ被通常用作檢測(cè)哺乳動(dòng)物自噬活性的重要指標(biāo)[9]。最近自噬流已在許多動(dòng)物模型上通過(guò)對(duì)自噬底物p62水平的檢測(cè)加以說(shuō)明[10]，p62可伴隨自噬流一起被水解，出現(xiàn)水平降低；當(dāng)自噬流障礙時(shí)水平升高。自噬在許多生理及病理情況下均可以被激活，如低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、線粒體功能異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及使用某些藥物治療等[11]。

近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，活性形式的維生素D3(vitamin D hormone,VDH)治療能夠改善TBI導(dǎo)致的認(rèn)知功能缺損和精神障礙[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠TBI模型，研究低濃度VDH對(duì)大鼠海馬組織內(nèi)LC3、p62蛋白表達(dá)和凋亡的影響，為臨床腦損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley大鼠45只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(260±20)g，由華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。購(gòu)入后在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在室溫(23±2)℃、相對(duì)濕度50%～65%標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下喂養(yǎng)。大鼠分為對(duì)照組(n=15)、模型組(n=15)和VDH組(n=15)。

1.2 試劑

VDH：美國(guó)SIGMA公司。DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。水合氯醛：北京中杉生物工程有限公司。TUNEL檢測(cè)試劑盒：美國(guó)ROCHE公司。兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗LC3多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體：美國(guó)SANTA CRUZ公司。

1.3 造模

TBI模型制作方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道有所改良。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，用大鼠腦立體定向儀將其頭部固定。將大鼠頭頂部手術(shù)區(qū)3×2 cm備皮，反復(fù)消毒3次后，于右側(cè)頂部，做正中矢狀位切口，并以矢狀縫左旁2 mm、前囟后2 mm為圓心，用顱骨鉆磨出一個(gè)直徑6 mm的骨孔。用鑷子小心去除骨瓣，充分暴露硬腦膜。將顱腦創(chuàng)傷儀的撞擊頭對(duì)準(zhǔn)大鼠骨孔，使撞擊頭與硬腦膜表面緊密貼合，按下按鈕，完成撞擊。撞擊參數(shù)設(shè)置：撞擊頭直徑3 mm，撞擊速度5 m/s，硬膜下陷深度2.5 mm，撞擊時(shí)間持續(xù)500 ms。撞擊完成后將大鼠頭皮縫合，待麻醉復(fù)蘇后將其放回籠中飼養(yǎng)。

對(duì)照組釆用同樣的麻醉及手術(shù)操作，不經(jīng)撞擊處理。

1.4 治療方法

VDH組分別于TBI造模后30 min、24 h、48 h腹腔注射VDH 1μg/kg[14]。VDH溶于5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中。其余組在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積5%DMSO。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

造模后3 d，每組取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，取全腦，海馬區(qū)切片，按TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。①石蠟切片二甲苯浸洗透明5 min，共2次；②依次用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)浸洗3 min；③組織用Proteinase K工作液處理15 min；④PBS漂洗5 min，共2次；⑤加TUNEL反應(yīng)混合液50μl，暗濕盒中37℃恒溫箱中反應(yīng)1 h；⑥PBS漂洗3 min，共3次；⑦組織切片上加DAB底物50～100μl，25℃恒溫箱中反應(yīng)10 min；⑧PBS漂洗3 min，共3次；⑨蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片；⑩光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5.2 Western blotting

造模后3 d，每組取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg麻醉大鼠，斷頭取腦，提取海馬組織進(jìn)行定量。將40μg蛋白與2×上樣緩沖液按體積1∶1比例混合，開(kāi)水煮沸5 min，選擇15%SDS-PAGE/5%積層膠上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2～3 h，加入兔抗LC3多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體及兔抗β-actin多克隆抗體，4℃搖床過(guò)夜，用TBST洗膜10 min，共3次；加入二抗，室溫下孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min，共3次；DAB顯色，圖像分析儀(美國(guó)BIO-RAD公司)測(cè)定光密度，計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin的比值進(jìn)行定量分析。

1.5.3 Morris水迷宮測(cè)試

Morris水迷宮測(cè)試為至今應(yīng)用最為廣泛的研究空間學(xué)習(xí)記憶功能的方法[15]。所有大鼠在造模前通過(guò)訓(xùn)練，使大鼠學(xué)會(huì)游泳，找到安全島的時(shí)間沒(méi)有差異。在TBI后第5、6、7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。測(cè)試開(kāi)始前，將直徑12 cm、高28 cm，且黑色不透明的安全島，隨機(jī)放于水迷宮四個(gè)象限中的任一象限，加水至安全島上方2 cm處，溫度22～25℃。將大鼠隨機(jī)放入四個(gè)象限，使大鼠頭部朝向桶壁，找到安全島的時(shí)間控制在60 s內(nèi)。在水迷宮上方安置攝像探頭，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄、拍攝和統(tǒng)計(jì)大鼠從其他三個(gè)象限找到安全島的軌跡和潛伏期。如果60 s內(nèi)大鼠沒(méi)有找到安全島，將其放在平臺(tái)上20 s，潛伏期記為60 s。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料者，采用(xˉ±s)描述，不同組別比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡

TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞胞核著色。模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組(P＜0.001)，VDH組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于模型組(P＜0.001)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 LC3蛋白和p62蛋白表達(dá)

模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，VDH組明顯低于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表2、圖2、圖3。

2.3 Morris水迷宮測(cè)試

模型組逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.01)，VDH組逃避潛伏期短于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表3。三組大鼠第5、6、7天的平均游泳速度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表1 三組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

表2 三組海馬組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62表達(dá)

表3 三組水迷宮測(cè)試逃避潛伏期比較(s)

表4 三組在水迷宮測(cè)試平均游泳速度比較(cm/s)

圖1 三組海馬組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，400×)

圖2 三組海馬組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較

圖3 三組海馬組織內(nèi)p62表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VDH在水迷宮試驗(yàn)中顯著降低TBI大鼠的逃避潛伏期，證明VDH的神經(jīng)保護(hù)作用，與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究相符[15-16]。

腦出血后的自噬由多個(gè)步驟組成，包括自噬的介導(dǎo)、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體、自噬溶酶體的降解。自噬流是這些步驟在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬將無(wú)法完成其生物學(xué)功能。

LC3是酵母ATG8的同源物，定位于自噬體內(nèi)外膜，參與自噬延長(zhǎng)階段[8]，其有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種存在形式，LC3Ⅱ在自噬體形成中起著關(guān)鍵作用，其與LC3Ⅰ的比值被通常用作檢測(cè)哺乳動(dòng)物自噬活性的重要指標(biāo)[9]。p62是一種指引泛素化蛋白進(jìn)入自噬體進(jìn)行降解的連接蛋白，可伴隨自噬流一起被水解，當(dāng)自噬流障礙時(shí)水平升高[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBI導(dǎo)致大鼠海馬組織內(nèi)自噬流的障礙，而VDH能夠緩解TBI后自噬流的障礙，這或許是其在大鼠TBI后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞給予自噬抑制劑氯喹干預(yù)后，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，提示自噬可以在應(yīng)激狀態(tài)下維持腫瘤和正常細(xì)胞的存活[18]。鋅離子同樣可以激活并增強(qiáng)自噬活動(dòng)，清除海馬區(qū)變構(gòu)或錯(cuò)誤折疊的β-淀粉樣蛋白和tau蛋白，對(duì)防治海馬損害引起的認(rèn)知功能障礙有重要作用，說(shuō)明激活自噬有益于疾病的恢復(fù)[19]。Zheng等[20]發(fā)現(xiàn)，腦缺血可以促進(jìn)自噬體和自噬溶酶體形成，提高LC3ⅡmRNA和蛋白表達(dá)水平，而自噬可能會(huì)加重神經(jīng)元損傷。但有學(xué)者利用敲除Atg7基因的小鼠造成腦缺血模型，自噬活動(dòng)消失，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)聚集和神經(jīng)元死亡，說(shuō)明自噬能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活[21]。Sadasivan等[22]采用可控皮質(zhì)沖擊損傷裝置制作腦外傷模型，發(fā)現(xiàn)急性腦外傷可以激活自噬，且自噬對(duì)腦功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用。

以自噬機(jī)制為靶點(diǎn)治療疾病，不僅涉及自噬對(duì)神經(jīng)元的直接保護(hù)作用[23]，且與其對(duì)免疫反應(yīng)[24]及凋亡[25]、壞死機(jī)制的影響有關(guān)。在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬與凋亡、壞死機(jī)制之間的復(fù)雜聯(lián)系在學(xué)術(shù)界仍存在著諸多爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，自噬促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制或許與抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，VDH治療在TBI后發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用[26-27]。另一方面，目前大部分學(xué)者更多地將VDH作為孕酮治療的輔助手段進(jìn)行研究[28]，而關(guān)于VDH單體治療對(duì)TBI的神經(jīng)保護(hù)分子機(jī)制研究還不夠深入。本研究并未涉及VDH影響自噬及凋亡的具體作用途徑及其分子機(jī)制，在今后研究中我們將引入激活劑或抑制劑進(jìn)一步探討VDH在發(fā)揮腦保護(hù)的作用機(jī)制。

綜上所述，VDH治療能夠改善大鼠TBI后認(rèn)知功能障礙，其分子機(jī)制與自噬的激活以及抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)，VDH作為神經(jīng)甾體，很可能成為一種頗有前景的TBI疾病治療藥物，其具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、較易獲取、不良反應(yīng)少和能夠長(zhǎng)期應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，有望為T(mén)BI及其并發(fā)癥的治療打開(kāi)新思路。

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