楊梅，羅逢建，陳宗懋，趙穎，朱國念*

1.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，310008；2.浙江大學農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，310058

近年來，茶葉質(zhì)量安全問題越來越受到關(guān)注，其中水溶性農(nóng)藥吡蟲啉和啶蟲脒農(nóng)藥殘留現(xiàn)象時有發(fā)生，特別是出口歐盟農(nóng)殘超標頻遭通報。目前，有關(guān)茶葉中吡蟲啉、啶蟲脒殘留的檢測方法主要有液相[1-2]、氣相[3-4]及超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[5]等，雖然這些方法檢測靈敏度和精確度都較高，但要使用大型色譜儀器，難以在基層普及，不利于大面積監(jiān)控。用于現(xiàn)場快速篩查農(nóng)藥殘留的方法主要是酶抑制法[6]，該方法主要用于檢測有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，受基質(zhì)干擾大，檢測假陽性比率偏高。近年來，基于抗原－抗體特異性反應(yīng)研制出煙堿類農(nóng)藥的ELISA試劑盒[7-8]，但其檢測方法需要多步反應(yīng)，不易于現(xiàn)場操作。因此，吡蟲啉和啶蟲脒金標速測試紙條技術(shù)將有效滿足市場監(jiān)測、企業(yè)收購、自查時的快速檢測需求，筆者就該速測技術(shù)對茶葉中吡蟲啉與啶蟲脒農(nóng)藥殘留快速檢測的效果進行了研究。

一、材料與方法

1.水溶性農(nóng)藥速測卡的檢測原理

基于直接競爭免疫層析法原理的金標速測試紙條（圖1），可用于快速檢測茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留。人工抗原和二抗以條帶狀固定包被于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線（T線）和對照線（C線），膠體金標記的抗體吸附在結(jié)合墊上，待測物與固定在硝酸纖維素膜上的包被抗原競爭結(jié)合金標抗體。將樣品溶液滴加到試紙條一端的樣本墊上后，在玻璃纖維的毛細作用下向另一端移動，流經(jīng)金標抗體結(jié)合墊溶解金標抗體并一同向上層析遷移，至T線時，固定在硝酸纖維素膜上的包被抗原與待測物一同競爭性地結(jié)合有限的金標抗體。之后未與固定在硝酸纖維素膜上的包被抗原結(jié)合的金標抗體繼續(xù)向上層析至C線，被固定在硝酸纖維素膜上的二抗特異性結(jié)合滯留于對照線并顯色。通過肉眼觀察比較T線和C線顏色的深淺差異進行結(jié)果判定：待測物濃度低于檢出限時，C線和T線兩條顏色相近；當待測物濃度等于或高于檢出限時，T線的顏色隨之變淺；當待測物達到一定濃度時，待測物完全占據(jù)金標抗體上的結(jié)合位點，固定在硝酸纖維素膜上的包被抗原未競爭結(jié)合到金標抗體，此時T線不顯色。C線均顯紅色條帶，若C線紅色條帶消失，則試紙條檢測失效。

圖1 水溶性農(nóng)藥速測試紙條檢測原理

2.試驗方案

選取涵蓋華南、江南、西南等我國主要產(chǎn)茶地區(qū)的茶葉進行水溶性農(nóng)藥速測卡應(yīng)用效果調(diào)查，包括安徽、重慶、四川、貴州、江西、山東、云南、河南、浙江、湖北、廣東、福建共計12個?。ㄊ校?。在每個地區(qū)寄送的速測樣品（表1）中隨機抽樣，用液質(zhì)聯(lián)用方法分析檢測，與速測結(jié)果不一致的樣品，將隨后進行第2次速測分析，計算出吡蟲啉、啶蟲脒在不同檢測范圍中速測卡的準確率、假陽性以及假陰性概率。

表1 各地區(qū)茶葉樣品數(shù)量

（1）速測卡測定步驟

鮮葉：稱取2g樣品，用研缽研磨后按1∶10（即1g樣品，10mL開水）加入20mL開水，混勻靜置10～15min至室溫。

干茶：稱取2g樣品，按1∶30（即1g樣品，30mL開水）加入60mL開水沖泡，混勻靜置10～15min至室溫。

用塑料滴管在平放的速測卡的兩個加樣孔中各滴入2滴提取液，10～15min內(nèi)觀察結(jié)果判斷有效（圖2）。

圖2 速測卡顯色示意圖（歐盟標準0.05mg/kg,國家標準GB2763暫按0.50mg/kg）

（2）速測卡結(jié)果判定

由圖2可知，陰性（－）結(jié)果為T線（檢測線，靠近加樣孔端）與C線顏色顯色接近，表明樣品中吡蟲啉、啶蟲脒含量均低于0.05mg/kg。陽性（＋）結(jié)果為T線比C線顏色明顯變淺或無顯色，表明樣品中吡蟲啉、啶蟲脒含量均高于0.05 mg/kg。無效為C線未顯色，可能是操作不當或檢測卡已失效。

（3）檢測效果驗證

樣品加標試驗：稱取干茶（綠茶）、鮮葉（龍井43）空白樣品各2g進行加標實驗，干茶樣品中加入吡蟲啉和啶蟲脒混標，添加水平分別為0、0.05、0.20、0.50mg/kg；鮮葉樣品中加入混標，添加水平為0、0.05、0.10mg/kg，按照上述操作進行檢測。

儀器檢測對比：按照食品安全國家標準《茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定液相色譜－質(zhì)譜法》（GB23200.13—2016）對茶葉中吡蟲啉、啶蟲脒殘留進行測定。速測卡結(jié)果與儀器分析結(jié)果比對，若儀器測定值在速測卡測定的范圍值內(nèi)（＜0.05mg/kg，0.05～0.50mg/kg，＞0.50mg/kg），認為速測卡測定準確，反之，速測卡測定不準確。計算公式：速測卡準確率=速測準確樣本數(shù)/實際有效樣本數(shù)×100%。

二、結(jié)果與分析

1.速測卡的檢測靈敏度

分別配制含有0、1、5、10μg/kg吡蟲啉、啶蟲脒單標的各基質(zhì)（綠茶、紅茶、鮮葉與水）溶液，按照檢測卡操作說明進行檢測，結(jié)果表明當各基質(zhì)中吡蟲啉、啶蟲脒含量達到5μg/kg時，能使T線消失，即吡蟲啉、啶蟲脒在茶湯中的檢測限均為5μg/kg。

2.樣品加標試驗結(jié)果

樣品中的農(nóng)藥濃度與T線顏色顯色呈負相關(guān)。當干茶樣品中吡蟲啉和啶蟲脒的添加水平均為0.50mg/kg時，T線完全消失；隨著樣品濃度的降低，T線顯色越來越明顯，當樣品中吡蟲啉、啶蟲脒含量低于0.05mg/kg時，T線與C線顏色顯色接近（圖3）；同樣，鮮葉中吡蟲啉、啶蟲脒含量為0.05mg/kg時，T線顯色較淺，而隨著樣品添加水平增加至0.10mg/kg時，T線幾乎不顯色（圖4）。

3.速測卡的準確性

抽檢綠茶、紅茶、鮮葉及其他（茉莉花、黑茶、白茶、烏龍茶和茶粉）類型茶共計154個樣品，其中有效樣品數(shù)量為145個（9個樣品速測結(jié)果失效，后續(xù)準確率計算時這些失效樣品均未統(tǒng)計），速測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果比對，吡蟲啉和啶蟲脒的半定量速測準確率分別達到91.5%和90.5%，假陽性概率分別為1.4%和2.4%，假陰性概率分別為3.5%和3.2%（表2）?？梢娝苄运贉y卡檢測吡蟲啉、啶蟲脒的結(jié)果是較為可靠的，可專門用于檢測茶葉的吡蟲啉、啶蟲脒農(nóng)藥殘留。

圖3 干茶中農(nóng)藥添加測定結(jié)果

圖4 鮮葉中農(nóng)藥添加測定結(jié)果

三、討論

新煙堿殺蟲劑對蜜蜂等傳粉昆蟲具有潛在的毒性與危害，迫使歐盟等多個國家開始重新評估此類殺蟲劑對環(huán)境的毒性與危害。早期，因新煙堿類農(nóng)藥對茶葉上的小綠葉蟬具有較好的防治效果，在我國茶園大面積使用；但吡蟲啉和啶蟲脒在茶湯中浸出率較高，存在飲茶安全隱患。為了更好地控制茶葉質(zhì)量安全，2009年，國家茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專家提出水溶性農(nóng)藥替代計劃，吡蟲啉、啶蟲脒農(nóng)藥的限制（不推薦）在茶葉上使用。因此，迫切需要一種能夠現(xiàn)場快速檢測茶葉中吡蟲啉、啶蟲脒殘留的產(chǎn)品，監(jiān)督并規(guī)范農(nóng)戶科學用藥。

由于吡蟲啉、啶蟲脒試紙條與其他煙堿類農(nóng)藥無明顯的交叉反應(yīng)[9]，而茶葉本身內(nèi)含物質(zhì)豐富，更容易引起速測結(jié)果的假陽性或假陰性。為了確保試驗結(jié)果的可靠性，可適當增加樣本的稀釋倍數(shù)，即增加提取溶劑水的比例。試紙條的檢出限（0.05mg/kg）與本研究中的液質(zhì)聯(lián)用儀器的檢出限（0.05mg/kg）一致，但兩者的樣品前處理方法不同，后者需通過提取、濃縮和凈化等多步處理才能得到待測樣品，而前者只需提取和稀釋即可得到待測樣品，因此試紙條方法具有方便快捷的優(yōu)勢。速測卡可適用于鮮葉、干茶（紅茶、綠茶、烏龍茶、花茶等）樣品的半定量測定，測定范圍：0.05～0.50mg/kg。目前，茶葉中吡蟲啉和啶蟲脒在國內(nèi)最大殘留限量分別為0.50mg/kg和10mg/kg[10]，歐盟的限量標準均為0.05mg/kg[11]。該測定范圍能夠滿足歐盟和中國對茶葉中的吡蟲啉、啶蟲脒的最大殘留限量的的不同檢測要求。

表2 茶葉中吡蟲啉與啶蟲脒農(nóng)藥殘留速測結(jié)果

因此，水溶性農(nóng)藥速測卡具有檢測時間短（10～15min）、靈敏度高（檢出限為0.05mg/kg）、操作簡單、成本低，對操作員技術(shù)水平要求低，在簡易實驗室甚至室外就能進行現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，也可為企業(yè)收購茶農(nóng)或其他來源的茶葉（鮮葉和干茶）、拼配、出口，以及市場抽查等情況下，吡蟲啉和啶蟲脒的農(nóng)殘檢測提供有效的初篩工具。

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