程 爽， 郭茂祖， 武雪劍

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 哈爾濱 150001)

引言

MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約19—22nt的非編碼單鏈RNA分子，是后轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程的重要角色[1]。miRNAs綁定在RNA沉默復(fù)合物(RISC)上，引導(dǎo)該復(fù)合物與靶標(biāo)mRNAs上的特殊位點(diǎn)配對(duì)，控制mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。目前的生物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)miRNA廣泛存在生物體中，一個(gè)miRNA能調(diào)控超過100種mRNA。同時(shí)，人體中有超過60%的蛋白編碼基因的mRNA 3’UTR區(qū)域包含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA優(yōu)勢(shì)調(diào)控了大量的細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、新陳代謝和死亡，這就充分說明了miRNA在動(dòng)物體內(nèi)基因調(diào)控過程中的現(xiàn)實(shí)重要性[1]。然而到目前為止，miRNA與基因的靶向規(guī)則依然未能收獲最高研究成果，為了揭示miRNA的功能，識(shí)別miRNA靶向機(jī)制以及靶標(biāo)基因即已成為當(dāng)前亟待解決的問題。具體分析可知，miRNA的研究一直以來就十分活躍，與miRNAs相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量也逐年攀升，值得一提的是，miRNAs靶向基因的識(shí)別方法在2003年以后即獲成熟實(shí)現(xiàn)與高效提出。比如一些文章集中研究生物學(xué)原理及檢驗(yàn)方法[2-3]，生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)和計(jì)算預(yù)測(cè)算法[4-6]。近期，大量文獻(xiàn)又深度探討了miRNA-mRNA的相互作用機(jī)制[7-10]。

本文首先介紹最近發(fā)表的miRNA靶向基因預(yù)測(cè)算法，總結(jié)miRNA目標(biāo)預(yù)測(cè)的研究進(jìn)展。miRNA靶向基因預(yù)測(cè)算法主要分為2類：ab initio計(jì)算方法和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，依據(jù)這一分類，本文綜述了具有代表性的方法，最后，討論目前的挑戰(zhàn)和未來方向。

1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

目前用于存放和共享miRNA-mRNA交互實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)被開發(fā)、并成功創(chuàng)立。TarBase[11]數(shù)據(jù)庫(kù)始建于2006年，經(jīng)過不斷的發(fā)展，目前版本為TarBase v7，其中收錄了近50萬的miRNA-gene的交互數(shù)據(jù)。TarBase提供了關(guān)于每個(gè)交互的更多細(xì)節(jié)，并且可以基于使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，調(diào)控類型(上調(diào)，下調(diào)與位置)與交互類型。miRecords[12]發(fā)布于2008年，迄今為止，該數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了由644miRNAs和1 901個(gè)靶基因組成的大約2 705條記錄。miRTarBase[13]收集miRNA-mRNA交互并且將miRNA-mRNA相互作用分為4類，包括功能性的、弱功能性的(非直接實(shí)驗(yàn)支持)、非功能性的和弱非功能性的，依賴于所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)的力量和交互的類型(積極的和消極的)。這種分類方法適用于關(guān)聯(lián)研究。starBase[14]重點(diǎn)選取了CLIP-seq數(shù)據(jù)，該類型的數(shù)據(jù)包含轉(zhuǎn)錄組范圍規(guī)模上的mRNA-miRNA-Argonaute復(fù)合物的交互位點(diǎn)。PMRD[15]是一個(gè)關(guān)于植物microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了miRNA序列、miRNA的靶基因、二級(jí)結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜和基因組信息等。miRNAMap[16]數(shù)據(jù)庫(kù)則動(dòng)態(tài)集成了實(shí)驗(yàn)證明的人類的、小鼠、大鼠以及其他多細(xì)胞動(dòng)物的miRNA靶基因。

2 miRNA靶向特征

miRNA靶基因識(shí)別的關(guān)鍵步驟是有效特征的選擇。時(shí)下，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)了大量的特征，但是目前只有一些通用miRNA-mRNA靶向規(guī)則獲得學(xué)界認(rèn)可，并相繼應(yīng)用在各種靶基因預(yù)測(cè)算法中。考慮miRNA和mRNA交互種子區(qū)域的重要性，即使得常規(guī)分類多呈現(xiàn)為種子區(qū)域和非種子區(qū)域，其中，種子區(qū)域的miRNA序列則尤其重要[17]，大量實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了種子區(qū)域的強(qiáng)互補(bǔ)性。同樣，非種子區(qū)域在雙重交互和加強(qiáng)吸引力方面也已成為一個(gè)重要角色，發(fā)揮出色作用[18]。其次，描述相互作用強(qiáng)度的最小自由能也展現(xiàn)了miRNA-mRNA普遍具有的特征[19]。第三，miRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)的序列具有明顯保守性，甚至是跨物種的保守性[20]。

3 計(jì)算方法

自2003年以來，miRNA靶向基因預(yù)測(cè)算法的研究已經(jīng)歷了十余年的發(fā)展歷程。當(dāng)前基于結(jié)構(gòu)特征的預(yù)測(cè)算法可劃分為2類：ab initio計(jì)算方法和機(jī)器學(xué)習(xí)方法?？偟貋碚f，最初提出的算法都是屬于ab initio類型，這些算法均是基于實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)構(gòu)特征來指引預(yù)測(cè)[20-25]。另一方面，機(jī)器學(xué)習(xí)方法[26-34]則是基于實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練集的相似度來識(shí)別候選靶向目標(biāo)，部分原因可歸結(jié)為：機(jī)器學(xué)習(xí)算法本就是在實(shí)驗(yàn)支持的靶向交互數(shù)據(jù)數(shù)量顯著增多時(shí)才應(yīng)運(yùn)而生的。下面即對(duì)上述2類中的代表性研究成果進(jìn)行逐一闡述及對(duì)比剖析。

3.1 ab initio方法

(1)miRanda[20]。適用范圍廣泛，不受物種限制。該算法考慮序列匹配，miRNA-mRNA雙鏈的熱穩(wěn)定性以及靶位點(diǎn)的跨物種保守性。其中，為了體現(xiàn)miRNA3’端、5’端和靶基因作用過程中的不對(duì)稱性，該軟件提出了scale參數(shù)。同時(shí)強(qiáng)調(diào)miRNA第2～4位堿基和靶基因精確互補(bǔ)，第3～12位堿基和靶基因錯(cuò)配不得多于5個(gè)等特征。

(2)TargetScan[17]算法。對(duì)靶基因跨物種保守性和miRNA-mRNA雙鏈二聚體熱力學(xué)特征做出限制。需要至少6nt的種子互補(bǔ)并且考慮種子類型。TargetScan發(fā)布的最新版本添加了一些額外的約束條件，例如種子配對(duì)穩(wěn)定性和目標(biāo)位點(diǎn)豐富性。

(3)PicTar[23]算法。關(guān)于種子區(qū)域制定了嚴(yán)格的要求，強(qiáng)調(diào)miRNA-mRNA二聚體結(jié)合能在靶基因翻譯抑制中的關(guān)鍵作用。同時(shí)也要一并考慮基于最小自由能的miRNA-mRNA雙鏈穩(wěn)定性。一旦位點(diǎn)匹配，可采用隱馬爾科夫模型給候選靶位點(diǎn)評(píng)分。

(4)RNA22[35]算法。是基于模式的發(fā)掘策略來識(shí)別候選目標(biāo)。該算法強(qiáng)調(diào)miRNA-mRNA二聚體的互補(bǔ)匹配特性和自由能，但不考慮靶基因的跨物種保守性。首先，馬爾科夫鏈用于模式發(fā)現(xiàn)，識(shí)別與miRNA匹配的目標(biāo)區(qū)域。其次，基于用戶設(shè)定的參數(shù)(配對(duì)堿基極小值，未配對(duì)堿基極大值，允許自由能的極大值)來選擇候選靶向區(qū)域。

(5)RNAhybrid[36]算法?；趍iRNA-mRNA二聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能這一特征，不僅考慮靶向結(jié)合位點(diǎn)的能量，也考慮miRNA-mRNA雙鏈的能量，但不再關(guān)注靶基因的跨物種保守性。RNAhybrid允許用戶自定義自由能閾值及p值，也允許用戶設(shè)置雜交位點(diǎn)的偏好等特征。

(6)PITA[37]算法。不僅考慮特定二聚體互補(bǔ)匹配信息，還引入了mRNA位點(diǎn)的可接近性?？山咏员硎玖苏麄€(gè)二聚體的最小自由能與互補(bǔ)匹配區(qū)域的原始能量ΔΔG之間的區(qū)別。用戶能夠強(qiáng)加不同的限制來減少候選合成集合(最小種子序列長(zhǎng)度，G∶U錯(cuò)配與未配對(duì)個(gè)數(shù))。

(7)EiMMo[25]算法。使用貝葉斯方法來給候選靶向位點(diǎn)打分，研究直系同源物種之間靶向位點(diǎn)的演化，并推斷功能性靶向位點(diǎn)的系統(tǒng)分布。

(8)DIANA[38]算法?；谝韵?點(diǎn)來判別miRNA靶基因：

① miRNA和靶基因間的高親和力，主要通過結(jié)合能來衡量；

② 影響miRNA和靶基因所形成二聚體莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)部位置和環(huán)大小的miRNA相關(guān)蛋白可能指導(dǎo)miRNA和靶基因的相互作用。同時(shí)，衡量每個(gè)基因時(shí)，不僅考慮保守位點(diǎn)，也包括不保守的位點(diǎn)。

在此，研究可得如上各類方法的主題網(wǎng)址及實(shí)用預(yù)測(cè)結(jié)果的對(duì)照比較，具體見表1。通過上述內(nèi)容分析可知，ab initio算法的不足是預(yù)測(cè)的結(jié)果假陽(yáng)性頗高。其有效的技術(shù)策略是，通過上述內(nèi)容分析可知，ab initio算法使用嚴(yán)格的限制條件來減少假陽(yáng)性預(yù)測(cè)結(jié)果的數(shù)量。然而，過濾也會(huì)使一些真正的靶基因發(fā)生丟棄。比如PicTar，TargetScan和DIANA，為了獲取可觀的正確度(約50%)，這些算法具有顯著妥協(xié)的敏感度(約10%)。而機(jī)器學(xué)習(xí)算法是實(shí)驗(yàn)支持的反例數(shù)量偏低(反例通常不會(huì)公開發(fā)布并且不會(huì)記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中)，導(dǎo)致正例和反例數(shù)量未臻均衡，影響分類模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。因此，接下來在分述機(jī)器學(xué)習(xí)算法的同時(shí)，也將全面拓展式地概述了這些方法所用的數(shù)據(jù)。

3.2 機(jī)器學(xué)習(xí)方法

(1)TargetBoost[26]算法。采用GPboost模型，考慮miRNA-mRNA二聚體的序列互補(bǔ)配對(duì)、熱力學(xué)穩(wěn)定性、跨物種保守性等特征，預(yù)測(cè)線蟲和果蠅miRNA的靶基因。用于訓(xùn)練的反例數(shù)據(jù)集包含300個(gè)隨機(jī)生成的序列，而正例數(shù)據(jù)集包含36個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-mRNA靶向關(guān)系。

(2)miTarget[27]算法。采用支持向量機(jī)方法，使用徑向基函數(shù)，預(yù)測(cè)目標(biāo)候選。其中考慮miRNA-mRNA二聚體的結(jié)構(gòu)特征、熱力學(xué)特征及堿基互補(bǔ)匹配等特征，但并未考慮靶基因的跨物種保守性。用于訓(xùn)練支持向量機(jī)的反例數(shù)據(jù)集包括83個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-mRNA靶向關(guān)系和163個(gè)通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推理得出的miRNA-mRNA靶向關(guān)系，正例數(shù)據(jù)集包括152個(gè)miRNA-mRNA靶向關(guān)系。

表1 預(yù)測(cè)miRNA靶基因的代表性ab initio方法Tab. 1 ab initio methods for miRNA target prediction

(3)Ensemble[28]算法。首先利用miRanda從miRNA-mRNA雙鏈中提取特征，之后采用多核SVM進(jìn)行預(yù)測(cè)。正例數(shù)據(jù)集包含48個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-mRNA交互，反例數(shù)據(jù)集包含16個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的反例miRNA-mRNA交互。

(4)NBmiRTar[29]算法。首先利用miRanda基于自由能和互補(bǔ)匹配的過濾條件篩選候選靶基因，之后利用樸素貝葉斯分類器計(jì)算每個(gè)候選靶基因的得分。反例數(shù)據(jù)集由38個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的和133 316個(gè)人工選擇的候選靶位點(diǎn)組成，正例數(shù)據(jù)集由225個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-mRNA交互組成。

(5)MiRTif[31]算法。首先綜合了miRanda，PicTar和TargetScan這3種預(yù)測(cè)方法得到的各種特征得分。然后使用支持向量機(jī)方法預(yù)測(cè)候選靶基因，核函數(shù)采用徑向基函數(shù)。正例數(shù)據(jù)集包含195個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶向交互，反例數(shù)據(jù)集包含了21個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的和17個(gè)假定的靶向交互。

(6)TargetMiner[32]算法。首先基于種子區(qū)域互補(bǔ)匹配的特性，選取合適的靶向位點(diǎn)，并得出相應(yīng)的特征得分。然后以此為依據(jù)，使用支持向量機(jī)模型預(yù)測(cè)靶基因，核函數(shù)采用徑向基函數(shù)。正例數(shù)據(jù)集包含764個(gè)靶向交互，反例數(shù)據(jù)集包含59個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的和289個(gè)假定的靶向交互組成。

(7)MTar[33]算法。選擇了3類區(qū)域的靶向位點(diǎn)，計(jì)算相應(yīng)區(qū)域miRNA-mRNA交互的特征得分(僅5’種子區(qū)域，5’種子區(qū)域占主要低位和以3’區(qū)域?yàn)橹?，然后使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)候選靶基因。正例數(shù)據(jù)集包含340個(gè)miRNA-mRNA靶向交互，反例數(shù)據(jù)集包含400個(gè)隨機(jī)的miRNA-mRNA靶向交互。

(8)TargetSpy[34]算法。首先生成候選靶向結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)候選靶向位點(diǎn)排序。并計(jì)算候選靶向位點(diǎn)的堿基組成，結(jié)構(gòu)特征以及堿基匹配互補(bǔ)等特征得分。正例集包含3 872個(gè)樣本，反例集合包含4 540個(gè)樣本。

(9)miREE[39]算法。首先利用遺傳算法來生成一個(gè)序列集合，之后利用支持向量機(jī)模型，采用徑向基函數(shù)，來預(yù)測(cè)候選靶基因。正例數(shù)據(jù)集包含324個(gè)靶向交互，反例數(shù)據(jù)集包含351個(gè)靶向交互。

(10)Target-align[40]。是一個(gè)基于Smith-Waterman的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件。為了得到局部最優(yōu)排列，Target-align依據(jù)堿基互補(bǔ)匹配程度構(gòu)建了得分矩陣，并采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法預(yù)測(cè)miRNA靶基因。

(11)miRTDL[41]算法?？紤]了miRNA-mRNA之間的互補(bǔ)匹配性、可接近性、保守性等特征。實(shí)驗(yàn)選擇了1 297個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的正例樣本，309個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的反例樣本，由于反例樣本數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于正例樣本數(shù)量，因此，該算法首先利用約束松弛方法構(gòu)建了均衡的正、反例數(shù)據(jù)集，之后采用深度學(xué)習(xí)模型，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。

至此，各種算法關(guān)聯(lián)的主題網(wǎng)址及機(jī)器學(xué)習(xí)方法的整體展現(xiàn)可見表2。

表2 預(yù)測(cè)miRNA靶基因的代表性機(jī)器學(xué)習(xí)方法Tab. 2 Machine learning methods for miRNA target prediction

綜上可知，這些方法大多利用miRNA和基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)層面的序列、能量等特征，選用計(jì)算方法識(shí)別miRNA的靶基因。近年來，還有一些研究者利用miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)或生物通路，以求通過表達(dá)值或miRNA在通路中的變化，來研究miRNA與基因的靶向關(guān)系。

3.3 其它方法

(1)MiRonTop[42]軟件。利用DNA微陣列數(shù)據(jù)和高通量測(cè)序數(shù)據(jù)來識(shí)別特定生物過程中潛在的miRNA靶基因，并設(shè)計(jì)了一定在線服務(wù)。用戶通過這個(gè)軟件可以快速查詢由其它軟件預(yù)測(cè)得出的靶基因。同時(shí)，通過調(diào)查靶位點(diǎn)在3’非編碼區(qū)域的位置，該軟件能夠?qū)⒑蜻x靶基因通過富集分析得到的最終得分提供給用戶。

(2)miRTar[43]軟件。分析了各種通路情況來識(shí)別基因轉(zhuǎn)錄本上的miRNA靶位點(diǎn)，并依據(jù)靶基因所在的生物通路來闡釋miRNA的生物功能。這個(gè)軟件通過分析特定通路來識(shí)別感興趣的miRNA和基因之間的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而闡釋生物通路中miRNA真實(shí)發(fā)揮的具體作用。

(3)mirSOM[44]軟件。利用自組織圖(self-organizing map)聚類方法，對(duì)3’非編碼區(qū)域的序列進(jìn)行聚類，該方法不僅能識(shí)別種子區(qū)域完美匹配的靶位點(diǎn)，也能發(fā)現(xiàn)不完美匹配的靶位點(diǎn)。

(4)文獻(xiàn)[45]。分別將關(guān)聯(lián)模型(Pearson)、因果推理模型(IDA)和回歸模型(Lasso)應(yīng)用到表達(dá)數(shù)據(jù)上，將得到的3類結(jié)果進(jìn)行綜合集成分析，由此證明集成方法與使用任一種模型的運(yùn)行設(shè)計(jì)相比，集成方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均占據(jù)了明確優(yōu)勢(shì)。

(5)文獻(xiàn)[46]。通過研究表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析miRNA和基因在不同通路中的表達(dá)情況，利用統(tǒng)計(jì)分析來確定miRNA的靶向基因。結(jié)果證明有21個(gè)miRNA在重疊的通路中得到了探知發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié)束語

時(shí)下，雖然已經(jīng)推出了大量的數(shù)據(jù)庫(kù)和預(yù)測(cè)軟件來預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，但是其中的大部分卻都具有較高的假陽(yáng)性，因此，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因仍是學(xué)界的挑戰(zhàn)性研究課題。當(dāng)今研究已經(jīng)引入了保守性和功能相似性來降低假陽(yáng)性結(jié)果，但應(yīng)該指出靶基因預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率也同樣存在著可觀的提升完善空間。比如，可以參考各種疾病通路，依據(jù)miRNA和基因在通路中的表達(dá)，來篩選候選靶基因。其次，隨著生物實(shí)驗(yàn)的高端推進(jìn)，會(huì)有越來越多的靶向規(guī)則將進(jìn)入學(xué)界視野，這也將顯著提高miRNA靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。另外，隨著高通量技術(shù)的飛速發(fā)展，使得短時(shí)間內(nèi)識(shí)別特定miRNA的靶基因終將成為現(xiàn)實(shí)可能。

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