趙晉楓 武寶愛

摘 要： 低密度脂蛋白受體（ Low density lipoprotein receptor， LDLR）與脂代謝關(guān)系密切，可以清除血漿中大部分膽固醇。近來離體研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇可以改變LDLR pre-mRNA的選擇性剪接導(dǎo)致變異剪接體LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12比例上升，而其生物學(xué)功能與全長(zhǎng)的LDLR有明顯差別。有氧運(yùn)動(dòng)可以增加全長(zhǎng)的LDLR的表達(dá)，起到降低血膽固醇的作用，但機(jī)制未明。新近研究表明，組蛋白修飾與pre-mRNA的選擇性剪接（LDLR pre-mRNA）有密切的關(guān)系。對(duì)近年來有氧運(yùn)動(dòng)降低高膽固醇血癥以及組蛋白修飾對(duì)于LDLR pre-mRNA選擇性剪接的影響進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步闡述有氧運(yùn)動(dòng)降低高膽固醇血癥機(jī)制研究提供新思路。

關(guān)鍵詞： 有氧運(yùn)動(dòng);高膽固醇血癥;LDLR;選擇性剪接;組蛋白修飾

中圖分類號(hào)：G804.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1006-2076（2018）06-0078-06

Abstract： Low density lipoprotein receptor （ LDLR ） is very important in lipid metabolism， which can clear most cholesterol in plasma. Recently in vitro studies showed that LDLR pre-mRNA alternative splicing can be altered by hypercholesteremia. In contrast to LDLR-FL， LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 expressions were increased by cholesterol-inducible. The biological role of LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 are significantly different from LDLR-FL. Aerobic exercise can degrade the blood lipids by increasing the expression of LDLR， but the mechanism is unknown. Alternative splicing of pre-mRNA is a prominent mechanism to generate protein diversity， yet its regulation is poorly understood. Histone modifications may have a significant effects in alternative splicing. We will focus on histone modification of LDLR pre-mRNA alternative splicing. In this study， we will summarize aerobic exercise reducing hypercholesterolemia and the histone modification for the impact of LDLR pre-mRNA alternative splicing， which provide useful references for the mechanism of aerobic exercise reducing hypercholesterolemia.

Key words： aerobic exercise;hypercholesteremia;LDLR;alternative splicing;histone modification

1 LDLR簡(jiǎn)介

研究表明， 低密度脂蛋白受體 （ Low density lipoprotein receptor， LDLR） 是一種表達(dá)豐富的膜糖蛋白，尤其在肝細(xì)胞中含量最多。LDLR的主要功能是清除血漿中的膽固醇，因此與脂代謝關(guān)系密切。該受體基因的異?？蓪?dǎo)致血漿中的膽固醇水平明顯升高，形成高膽固醇血癥。而動(dòng)脈粥樣硬化形成的首要危險(xiǎn)因素就是高膽固醇血癥，動(dòng)脈粥樣硬化可以引發(fā)冠心病、腦血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，防治高膽固醇血癥對(duì)控制心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。

人類的LDLR基因全長(zhǎng)約為45 kb，有17個(gè)內(nèi)含子和18個(gè)外顯子，該基因位于第19號(hào)染色體的斷臂[2]。LDLR 蛋白分子量約為160 KD，由839個(gè)氨基酸殘基組成，共有5個(gè)功能相異的結(jié)構(gòu)域：1）配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由外顯子2～6編碼，292個(gè)氨基酸殘基組成;2）表皮生長(zhǎng)因子（EGF）前體結(jié)構(gòu)域，由外顯子7～14編碼，400個(gè)氨基酸殘基組成;3）糖鏈化結(jié)構(gòu)域，由外顯子15編碼，58個(gè)氨基酸殘基組成;4）跨膜結(jié)構(gòu)域，外顯子16、17的部分序列編碼，22個(gè)氨基酸殘基組成;5）胞漿結(jié)構(gòu)域，由外顯子17的部分序列及外顯子18編碼，50個(gè)氨基酸殘基組成[2]（圖[KG-*9]1A）。LDLR的主要功能是攝取血液中的低密度脂蛋白（LDL）或其他含ApoB100、E的脂蛋白如極低密度脂蛋白（VLDL）等，將他們內(nèi)吞入細(xì)胞獲得膽固醇，用于固醇類激素的合成及細(xì)胞增殖，這種代謝過程稱為L(zhǎng)DLR途徑（LDLR pathway）。試想如果LDLR表達(dá)減少或功能受損，不能有效清除血液循環(huán)中的LDL及VLDL，就會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥以及其他心腦血管疾病[3]。

2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于LDLR的影響

有氧運(yùn)動(dòng)，是指以有氧氧化為供能方式的運(yùn)動(dòng)，供能的主要物質(zhì)糖可以完全分解為水和二氧化碳，并釋放出大量的能量供給人體，通過有氧運(yùn)動(dòng)可以有效地提高人體的心肺功能。有氧運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)包括低強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間、慢速度、長(zhǎng)距離等。有氧運(yùn)動(dòng)多是一些周期性的運(yùn)動(dòng)，例如走、跑、騎自行車、游泳和劃船等。人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究都證明，適度的有氧運(yùn)動(dòng)可以有效地降低血液中的血脂水平，包括總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），同時(shí)可以升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），起到很好的降低血脂的作用[4-6]。

目前為止，對(duì)于有氧運(yùn)動(dòng)是如何影響LDLR的報(bào)道很少，但是結(jié)果比較一致。這些研究結(jié)果都認(rèn)為有氧運(yùn)動(dòng)可以增加LDLR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并能增加LDLR的活性，從而可以有效地改善血脂水平。顏宜苣等的研究顯示，高膽固醇血癥大鼠肝臟的LDLR活性下降，而通過耐力性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后LDLR活性升高，從而起到降低血脂的作用[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠有氧運(yùn)動(dòng)組肝臟的LDLR mRNA水平比高脂組高3倍，LDLR的蛋白表達(dá)水平也比高脂組高1倍左右[8]。Wilund等在研究大鼠通過耐力運(yùn)動(dòng)減少膽結(jié)石形成時(shí)發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠肝臟的LDLR增加了大約2倍[9]。此外，還有人體實(shí)驗(yàn)證明，步行可以通過增加LDLR的表達(dá)從而起到降低膽固醇的作用[10]。

有氧運(yùn)動(dòng)是如何引起LDLR轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加的具體機(jī)制還不清楚，可能與以下因素有關(guān)：1）過氧化物酶增殖活化受體（PPAR）：運(yùn)動(dòng)可使肝臟中的PPARα在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上有所提高，而PPARα可誘導(dǎo)LDLR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而降低血中的LDL含量[11]。2）胰島素：研究顯示，胰島素可以促進(jìn)LDLR啟動(dòng)子活化，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[12]，而有氧耐力運(yùn)動(dòng)可以提高肝組織對(duì)胰島素的敏感性。3）雌激素：雌激素可以上調(diào)LDLR的活性，從而起到降低膽固醇的效應(yīng)[13]，而有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著提高絕經(jīng)婦女的雌激素水平[14]。

3 LDLR pre-mRNA的選擇性剪接

選擇性剪接是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要方面，是高等真核生物利用有限數(shù)量的基因產(chǎn)生眾多蛋白質(zhì)的主要機(jī)制[15]。根據(jù)序列測(cè)定方法論顯示人類基因有95%以上都經(jīng)歷了選擇性剪接[16]。

Tveten等在人的8種不同組織和4種不同細(xì)胞系中提取總RNA，使用不同引物（RT-PCR分析）證實(shí) LDLR pre-mRNA 存在很多變異剪接體 [17]。通過對(duì)外顯子1～8及外顯子3～10的分析發(fā)現(xiàn)了外顯子4的缺失，對(duì)外顯子7～14和外顯子11～17的分析發(fā)現(xiàn)了外顯子12的不表達(dá)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種缺失的變異剪接體與高膽固醇血癥密切相關(guān)[18]。此外，還發(fā)現(xiàn)有其他的變異剪接體形式。

從圖1B中可以看到，人的LDLR全長(zhǎng)（LDLR-FL）共有18個(gè)外顯子，缺失第4外顯子后，共缺失了127個(gè)氨基酸殘基，此區(qū)域位于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（外顯子2～6編碼），因此缺失第4外顯子的變異剪接體 （LDLR-△Exon4）影響與配體 LDL 的結(jié)合。缺失第12外顯子后，共缺失了47個(gè)氨基酸殘基，缺失的區(qū)域位于EGF前體結(jié)構(gòu)域（外顯子7～14編碼），此區(qū)域?qū)儆诩?xì)胞膜外結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì) LDLR 起著支撐作用。所以缺失第12外顯子的變異剪接體 （LDLR-△Exon12） 也會(huì)部分失去 LDLR 的功能，從而影響對(duì)膽固醇的清除[19-20]。

Medina等人的研究顯示，培養(yǎng) HepG2 肝細(xì)胞系，當(dāng)膽固醇缺失時(shí)，選擇性變異剪接體無論是 LDLR-△Exon4 還是 LDLR-△Exon12 的表達(dá)都下降，而加入LDL-膽固醇或是25-羥基膽固醇時(shí)，表達(dá)則明顯上升（圖2）。過量膽固醇喂養(yǎng)的非洲綠猴肝臟，經(jīng) RT-PCR 分析 LDLR-FL 表達(dá)下降，另外肝的總膽固醇的增加與 LDLR-△Exon12 的增加有正比例關(guān)系[18]。這些都提示在高膽固醇血癥時(shí)，LDLR pre-mRNA 的選擇性剪接與正常情況不同。

A：LDLR 結(jié)構(gòu)示意圖。LDLR 由5個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域組成，即配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、EGF前體結(jié)構(gòu)域、糖鏈化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域。B：LDLR全長(zhǎng)及其選擇性變異剪接體模式圖。LDLR-FL 有18個(gè)外顯子，缺失第4外顯子后，共缺失127個(gè)氨基酸殘基，且此區(qū)域位于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（外顯子2～6編碼）;缺失第12外顯子后，共缺失47個(gè)氨基酸殘基，缺失區(qū)域位于EGF前體結(jié)構(gòu)域（外顯子7～14編碼）。這預(yù)示著無論是 LDLR-△Exon4 還是 LDLR-△Exon12 與 LDLR-FL 的生物學(xué)功能都有差別。

HepG2 細(xì)胞系被孵育 10%LPDS（缺乏脂蛋白血清）或是 10%FBS（胎牛血清）。24小時(shí)之后 10%FBS 孵育的細(xì)胞加入 50 mg/ml LDL-膽固醇或是 1 mg/ml 25-羥基膽固醇。從圖2中可以看到用缺乏脂蛋白血清培養(yǎng)的細(xì)胞，無論是LDLR-△Exon4 還是LDLR-△Exon12 的表達(dá)都下降，而加入LDL-膽固醇或是25-羥基膽固醇時(shí)，表達(dá)明顯上升。在正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)為1，顯示的值為與正常培養(yǎng)條件下的比（圖片摘自 Marisa W M，2011）。

4 表觀遺傳機(jī)制對(duì)Pre-mRNA選擇性剪接的調(diào)控作用研究現(xiàn)狀

選擇性剪接是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其調(diào)控機(jī)制更是涉及到多水平、多因素的綜合作用。以往認(rèn)為選擇性剪接的調(diào)控主要涉及順式作用元件和反式作用因子（順式作用元件包括剪接增強(qiáng)子和沉默子，可位于內(nèi)含子也可位于外顯子，反式作用因子就是剪接調(diào)節(jié)蛋白，主要包括SR蛋白家族和 hnRNPs 等），剪接調(diào)節(jié)蛋白可與剪接增強(qiáng)子或沉默子結(jié)合，從而調(diào)控選擇性剪接[21]。而最新的研究表明，表觀遺傳機(jī)制尤其是組蛋白修飾參與選擇性剪接的調(diào)控[22]。例如，在細(xì)胞系中加入組蛋白脫乙?；敢种苿?TSA 后，可引起纖維結(jié)合蛋白的選擇性外顯子33被切除，以及神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的外顯子18也可被切除[23-24]。這些研究說明組蛋白修飾在不同 pre-mRNA 的選擇性剪接中發(fā)揮了重要作用。

目前認(rèn)為，組蛋白修飾影響 pre-mRNA 的選擇性剪接主要有兩個(gè)機(jī)制：

1）招募模型機(jī)制 組蛋白的不同修飾可以招募不同的染色質(zhì)結(jié)合蛋白以及剪接因子，從而改變 pre-mRNA 的選擇性剪接格局。人的纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（human fibroblast growth factor receptor 2， FGFR2）基因外顯子Ⅲb 和 Ⅲc 是互相排斥的，而且存在組織特異性。這兩個(gè)外顯子在不同組織的保留是由多聚嘧啶束結(jié)合蛋白（PTB，可與剪接因子 U2AF 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3剪接位點(diǎn)，從而對(duì) pre-mRNA 的剪接起到負(fù)性調(diào)控作用[35]）進(jìn)行調(diào)節(jié)的，PTB 結(jié)合在外顯子Ⅲb周圍的沉默元件上，從而導(dǎo)致外顯子Ⅲb被切除。在前列腺上皮細(xì)胞外顯子Ⅲb 表達(dá)，這時(shí) H3K27 三甲基化、H3K4 三甲基化含量較高;而間充質(zhì)干細(xì)胞主要表達(dá)外顯子Ⅲc，此時(shí) H3K4 的一甲基化、H3K36 的三甲基化比較豐富[25]。其機(jī)制解釋為：當(dāng) H3K36 的三甲基化含量豐富時(shí)，可與染色質(zhì)結(jié)合蛋白（MRG15）結(jié)合，MRG15又可與 PTB 相連，通過 PTB 與剪接因子 U2AF 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3剪接位點(diǎn)，從而影響外顯子Ⅲb使其被剪切掉[25];H3K36 的三甲基化還可以識(shí)別染色質(zhì)結(jié)合蛋白Psip1，招募剪接因子 SRSF1，對(duì)選擇性剪接進(jìn)行調(diào)節(jié)[26]。除此之外，細(xì)胞周期蛋白D1（CHD1）可以特異地識(shí)別 H3K4 的三甲基化，并與 U2snRNP 相互作用，繼而影響選擇性剪接的發(fā)生[27];Gcn5 可以與組蛋白 H3 的乙?；稽c(diǎn)結(jié)合，招募剪接因子 U2snRNP[28];HP1α 蛋白能識(shí)別組蛋白 H3K9 的三甲基化，招募剪接因子 hnRNPs，從而影響選擇性剪接的格局[29]（圖3）。

2）動(dòng)態(tài)模型機(jī)制 研究表明染色體的組蛋白修飾可以改變 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，而 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率可以影響剪接因子與內(nèi)含子3剪接位點(diǎn)的識(shí)別，從而產(chǎn)生不同的選擇性剪接格局。因此，動(dòng)態(tài)模型機(jī)制主要涉及兩個(gè)關(guān)鍵因素：① 在不同內(nèi)含子3端存在剪接位點(diǎn)強(qiáng)弱的差別[30];② RNA 聚合酶Ⅱ延伸速率存在差別，由此形成轉(zhuǎn)錄速度的快慢從而影響選擇性剪接。在生理?xiàng)l件下，組蛋白修飾的格局利于 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率較慢，剪接因子可對(duì)較強(qiáng)的或較弱的剪接位點(diǎn)都進(jìn)行識(shí)別，依次將內(nèi)含子切除產(chǎn)生完整（全長(zhǎng)）肽段;當(dāng)受到刺激時(shí)組蛋白修飾的格局發(fā)生變化，RNA聚合酶Ⅱ延伸速率加快，這時(shí)剪接因子直接識(shí)別較強(qiáng)的剪接位點(diǎn)，從而使與較弱剪接位點(diǎn)相連的外顯子被切除的概率大大增加[31-32]。研究顯示，組蛋白H3K9、H3K27、H3K36等乙?；凹谆降母淖儯梢杂绊?RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，從而導(dǎo)致選擇性剪接形式的改變[33-34]。

5 有氧運(yùn)動(dòng)是否可通過影響LDLR pre-mRNA的選擇性剪接降低血膽固醇

前已述及，高膽固醇血癥時(shí)，肝臟的LDLR表達(dá)下調(diào)，而通過有氧運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)LDLR 在肝臟的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而減少脂質(zhì)沉積，促進(jìn)脂質(zhì)清除，起到降低血膽固醇的作用[7-10]。但是有氧運(yùn)動(dòng)是如何引起LDLR表達(dá)增加，機(jī)制未明，以及有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于LDLR pre-mRNA的選擇性剪接是否有影響均沒有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們提出了假設(shè)，在高膽固醇血癥時(shí)，LDLR pre-mRNA的選擇性剪接發(fā)生了改變，LDLR-FL減少，選擇性變異剪接體LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12增加（由于選擇性變異剪接體與全長(zhǎng)的功能有明顯差別，所以起不到降低膽固醇的作用），從而影響對(duì)LDL的清除;而在有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)，LDLR-FL表達(dá)增加，選擇性變異剪接體LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12減少，從而可以有效地降低血液中的膽固醇。此外，我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證實(shí)，在高膽固醇血癥時(shí)，LDLR的選擇性剪接確實(shí)發(fā)生了改變，包含Exon4的LDLR表達(dá)減少，而選擇性變異剪接體LDLR-△Exon4表達(dá)增加;而在有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)，包含Exon4的LDLR表達(dá)增加，選擇性變異剪接體LDLR-△Exon4表達(dá)減少，這與我們的假設(shè)相吻合，有氧運(yùn)動(dòng)確實(shí)可以改變LDLR pre-mRNA的選擇性剪接。由于LDLR的變異剪接體LDLR-△Exon12與高膽固醇血癥也密切相關(guān)[18]，因此，高膽固醇血癥及有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后對(duì)LDLR-△Exon12的表達(dá)是否有影響，還有待于我們的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

6 LDLR pre-mRNA選擇性剪接組蛋白修飾機(jī)制調(diào)控

組蛋白修飾對(duì)于選擇性剪接調(diào)節(jié)的直接證據(jù)來自于分析一系列基因的組蛋白修飾與選擇性剪接的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，一些基因的選擇性剪接依賴于多聚嘧啶束結(jié)合蛋白（PTB）剪接因子[29]。PTB 可以與剪接因子 U2AF 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3剪接位點(diǎn)，從而對(duì) pre-mRNA 的剪接起到負(fù)性調(diào)控作用[35]。Marisa 等人的研究顯示，HepG2 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染 PTB 的干擾 RNA 后，PTB mRNA 表達(dá)下降到68%，蛋白表達(dá)下調(diào)到66%。此時(shí)，檢測(cè)到選擇性變異剪接體 LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12表達(dá)都下調(diào)，說明 LDLR 是 PTB 作用的靶基因[18]（圖4）。因此，我們推論 LDLR pre-mRNA 的第4、第12外顯子缺失是由 PTB 進(jìn)行調(diào)節(jié)的，那么根據(jù)招募模型機(jī)制推測(cè)，在高膽固醇血癥時(shí)，組蛋白修飾的格局（H3K36 的三甲基化水平在外顯子4或12周圍水平升高），可與染色質(zhì)結(jié)合蛋白（MRG15）結(jié)合，MRG15 又可與 PTB 相連，通過 PTB 與剪接因子 U2AF 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 3剪接位點(diǎn)，從而影響外顯子4或12使其被切除，LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12 產(chǎn)物的比例將明顯上升，LDLR-FL 表達(dá)下降，從而不能有效地降低血膽固醇（圖5）。簡(jiǎn)言之，組蛋白修飾可能在 LDLR pre-mRNA 的選擇性剪接中發(fā)揮了重要作用。

RNA干擾PTB后，從圖4中我們可以看到LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12產(chǎn)物表達(dá)下調(diào)。在正常培養(yǎng)條件下的表達(dá)為1，所得值為與正常培養(yǎng)條件的比（圖片摘自 Marisa W M，2011）。

7 小結(jié)

有氧運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)LDLR 在肝臟的表達(dá)，降低血膽固醇早有文獻(xiàn)報(bào)道，但其確切的機(jī)制尚不清楚。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)初步證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可以改變LDLR pre-mRNA的選擇性剪接，LDLR-FL表達(dá)增加，選擇性變異剪接體LDLR-△Exon4減少，從而可以有效降低血液中的膽固醇。但是LDLR pre-mRNA的選擇性剪接又受誰調(diào)控，組蛋白修飾又在其中起到了什么樣的作用，都需進(jìn)一步研究。

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