邵承穎等

摘 要：目的：探討8周有氧運動對心肌梗死大鼠心臟交感重構(gòu)的影響及其機制。方法：42只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、心肌梗死組、心肌梗死+有氧運動組。結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備大鼠心肌梗死的模型，術(shù)后1周心肌梗死+有氧運動組成活大鼠進行8周跑臺運動。采用免疫組織化學方法觀察心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維分布及表達；采用western blot檢測心肌中NGF蛋白表達；采用實時定量RT-PCR檢測IL-1β及TNF-α mRNA表達。結(jié)果：與假手術(shù)組大鼠相比，心肌梗死組心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加（P<0.01），形態(tài)粗大且空間分布紊亂；NGF蛋白，IL-1β及TNF-α mRNA表達顯著上調(diào)。有氧運動干預后心肌組織神經(jīng)纖維密度明顯降低（P<0.01），形態(tài)更趨于正常；心肌中NGF、IL-1β及TNF-α表達顯著下降。結(jié)論：有氧運動減少心肌梗死后心肌局部炎癥反應，下調(diào)梗死灶周組織NGF表達，抑制交感神經(jīng)過度再生，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)。

關(guān)鍵詞：有氧運動；心肌梗死；神經(jīng)重構(gòu)；炎癥

中圖分類號：G804.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2015）03-0073-05

Abstract：Objective：To investigate the role of aerobic exercise in ameliorating sympathetic sprouting after myocardial infarction （MI） in rat hearts.Methods： 42 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups： sham group， MI and MI with aerobic exercise （MI+ME） group. An MI model was induced by ligation of the coronary artery； the rats in MI+ME group were assigned to 8 weeks of exercise. Immunohistochemistry was used to measure the density of nerve fibers positive for growth-associated protein 43 （GAP43） and tyrosine hydroxylase （TH）. The protein levels of nerve growth factor （NGF） were detected by western blot analysis. The mRNA levels of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were examined by quantitative real-time PCR.Results：Compared with the sham-operated hearts， MI increased the density of[HK][HT]

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康成年雄性SD大鼠42 只，體重250-280g（購自山東大學實驗動物中心）。Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；Real-time RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司設(shè)計并合成；抗酪氨酸羥化酶（TH）抗體購于美國Millipore公司，抗生長相關(guān)蛋白43（GAP43）抗體購于英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記兔抗綿羊二抗購于美國PKL公司，抗NGF抗體購于美國Epitomics公司，抗GAPDH抗體購于北京康為世紀生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌梗死模型制備

SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、單純心肌梗死組（心肌梗死組）以及心肌梗死+有氧運動組（有氧運動組），每組14只。利用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制備大鼠心肌梗死的模型[7]，所有動物用10% 水合氯醛溶液0.3 mL/100g腹腔注射麻醉，氣管插管，小動物呼吸機通氣。于大鼠胸骨左側(cè)3-4肋間開胸，結(jié)扎左前降支，以心電圖aVL導聯(lián)ST段抬高 0.2 mV作為手術(shù)成功標志，隨后逐層關(guān)胸。假手術(shù)組大鼠作為對照，只開胸穿線，不結(jié)扎。

有氧運動組大鼠手術(shù)恢復1周后參照Kemi OJ[8]的運動方案進行訓練：動物跑臺運動速度為15 m/min，大鼠進行適應運動10 min；將跑臺運動速度增至20 m/min，持續(xù)運動50 min。大鼠運動60 min/d，5次/周，共計8周。假手術(shù)組及心肌梗死組正?；\內(nèi)喂養(yǎng)不運動。

1.2.2 心肌標本處理

實驗大鼠8周有氧運動干預后，所有成活大鼠再次麻醉并迅速取下心臟，經(jīng)主動脈灌注生理鹽水清除殘存血液。取梗死灶周（梗死蒼白邊緣3 mm以內(nèi)）心肌組織，假手術(shù)組取相應部分心肌組織，分別存放于中性甲醛及液氮中保存。

1.2.3 GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維密度測定

取甲醛固定后的心肌組織，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，常規(guī)脫蠟、高壓修復后加一抗4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，復染后封片。參照Cao等[9]的方法，選取神經(jīng)分布較為密集的區(qū)域?qū)ι窠?jīng)纖維密度進行分析：采用Image Pro Plus5圖像處理分析軟件定量分析GAP43及TH陽性神經(jīng)纖維在所選區(qū)域中所占面積（以μm2/mm2表示），取其平均值作為陽性神經(jīng)纖維密度值。

1.2.4 心肌中NGF蛋白表達

將心肌組織切成細小碎片，每100 mg 組織加1 mL心肌組織裂解液冰上勻漿，提取蛋白。用12%分離膠、5%濃縮膠100 V電泳60 min，160 V恒壓電轉(zhuǎn)60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗（1[JX-*4]：[JX*4]500），4°C過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗（1[JX-*4]：[JX*4]10000）室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影，Image J圖像處理軟件，以內(nèi)參GAPDH蛋白條帶光密度值為標準，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.5 IL-1β及TNF-α mRNA表達

[JP3]根據(jù)Trizol試劑盒提供的方法提取心肌組織總mRNA。按照real-time RT-PCR試劑盒的方法進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。引物序列：IL-1β，上游 5-AGT GGC AAT GAA AAT GAC CTG-3，下游 5-CAC AAC GAC TGA CAA GAC CTG-3；TNF-α，上游5-CTG CCT CAG CCT CTT CTC TTT-3，下游 5-CAC TTG CGG GTT TGC TAC TAC-3；GAPDH，上游5-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3，下游5-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3。GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。[JP]

1.2.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（[AKx-]±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，然后采用最小顯著差異法進行組間兩兩比較。P<0.05為統(tǒng)計學差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支后數(shù)分鐘后可發(fā)現(xiàn)結(jié)扎動脈供血區(qū)域心肌顏色呈暗紅色，搏動減弱，與非梗死區(qū)分界明顯。8周有氧運動結(jié)束后，假手術(shù)組無死亡，共14例大鼠完成實驗；心肌梗死組有4例死亡，共10例大鼠完成實驗；有氧運動組有2例死亡，共12例大鼠完成實驗。

2.2 心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維分布及表達

假手術(shù)組GAP43陽性神經(jīng)纖維少見或缺如，呈點狀分布；心肌梗死組梗死灶周處心肌中GAP43陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，分布密集且形態(tài)粗大；與心肌梗死組相比，有氧運動組心肌組織的GAP43陽性神經(jīng)纖維密度明顯減少（P<0.01），分布較為稀疏（圖1A，表1）。

假手術(shù)組TH陽性神經(jīng)纖維在心肌組織中均勻分布，沿心肌纖維縱行分布；心肌梗死組TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，空間分布紊亂，形態(tài)異常，部分聚集成束，偶可相互交錯呈網(wǎng)狀；與心肌梗死組相比，有氧運動組TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯降低（P<0.01），且形態(tài)更趨于正?；?，未發(fā)現(xiàn)粗大、密集的神經(jīng)纖維束。（圖1B，表1）。

3 討論

正常生理情況下，交感神經(jīng)以其“固有”形式分布于心臟，但在某些心臟病變情況下，其支配形式也會發(fā)生改變，繼而引起功能學的改變。心肌缺血可引起心臟去神經(jīng)支配、神經(jīng)再生、交感神經(jīng)過度支配，即交感神經(jīng)重構(gòu)這一系列動態(tài)改變。這種心臟交感神經(jīng)的異常支配加重了MI后心肌的電生理異質(zhì)性及不穩(wěn)定性，進而導致室性心律失常易感性增加[9]。在本實驗中，我們選取GAP43及TH作為神經(jīng)標記物研究MI后交感神經(jīng)再生現(xiàn)象。與既往研究結(jié)果一致[9-10]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死灶周GAP43及TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，且空間分布紊亂，形態(tài)異常，部分聚集成束，偶可相互交錯呈網(wǎng)狀。該結(jié)果進一步證實MI可導致梗死灶周組織不同程度的交感神經(jīng)再生及紊亂的交感神經(jīng)支配，即交感神經(jīng)重構(gòu)。

NGF，作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的代表，對交感神經(jīng)的生長、延伸、突觸功能調(diào)控都有重要作用。NGF與靶細胞上TrkA或p75NTR受體結(jié)合，啟動下游MAPK/ERK通路，進而促進交感神經(jīng)生長及軸突延伸[11]。多項研究證實，MI后心肌局部NGF表達明顯上調(diào)，且NGF在時間-空間的動態(tài)表達變化與交感神經(jīng)密度呈正相關(guān)[3，10，12]。隨著研究的進一步深入，炎癥反應與交感神經(jīng)再生的關(guān)系逐漸引起科研人員的關(guān)注。梗死心肌組織周圍的巨噬細胞可合成并分泌大量NGF[3-4]；此外，IL-1β、TNF-α等炎癥因子也可通過多種途徑上調(diào)NGF及其受體p75NTR的表達[13]，從而促進交感神經(jīng)軸突延伸、生長，并導致交感神經(jīng)過度增生及重構(gòu)。在本實驗中，我們選取IL-1β、TNF-α作為炎癥指標，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心肌中IL-1β、TNF-α相應的mRNA表達均有不同程度的上調(diào)，同時NGF含量也顯著增加，我們的結(jié)果進一步證實MI后NGF表達與炎癥反應密切相關(guān)，炎癥反應的程度直接影響著心肌梗死后心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的過程。

近年來，有氧運動被認為是多種心血管疾病的有效治療及康復手段。業(yè)已證實，MI早期適宜強度的有氧運動可通過逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)[14]、增加每搏輸出量及射血分數(shù)[15]、改善左室收縮功能[16]等發(fā)揮心臟保護作用。此外，一系列臨床研究表明，長期有氧運動可降低心臟交感神經(jīng)張力，從而減少室性心律失常的發(fā)生[17-18]；Hautala等[19]在校正受試者年齡、訓練時間等因素后發(fā)現(xiàn)，每周進行3次30 min預計最大心率60%至80%強度范圍的有氧運動，并持續(xù)四周以上，可顯著增強心臟迷走神經(jīng)張力。但目前關(guān)于有氧運動調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)支配平衡的機制尚無分子學方面的合理解釋。Adamopoulos等[20]的研究表明，有氧運動可減少心衰患者外周血液中的炎癥因子的表達，且有氧運動對心臟的保護作用與其抗炎作用密切相關(guān)。因此，在本實驗中，我們將“有氧運動—炎癥—NGF—神經(jīng)再生”為研究主線，結(jié)果顯示，8周有氧運動可顯著下調(diào)心肌中IL-1β、TNF-α的水平，降低心肌中NGF表達并有效改善MI后心臟交感神經(jīng)再生及重構(gòu)。因此，我們認為，有氧運動可通過減輕心肌局部炎癥反應以抑制心臟交感神經(jīng)過度再生，這也可能是有氧運動降低交感神經(jīng)張力、增強迷走神經(jīng)張力的可能機制之一。此外，有研究證實，迷走神經(jīng)興奮釋放的乙酰膽堿可作用于諸多炎癥細胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體，激活JAK2/STAT3通路，抑制促炎因子釋放，從而發(fā)揮“迷走神經(jīng)抗炎作用”[21]。在本實驗中我們尚無法明確有氧運動是直接抑制炎癥反應，抑或通過興奮迷走神經(jīng)間接抑制炎癥反應，但我們的研究已初步證實有氧運動可通過減輕MI后心臟炎癥反應，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)，該研究結(jié)果也為有氧運動對心肌梗死后心源性猝死的有效防治提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

8周有氧運動可減輕心肌梗死后心肌局部炎癥反應，下調(diào)梗死灶周組織NGF表達，抑制交感神經(jīng)過度再生，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)。

參考文獻：

[1]Myerburg RJ， Junttila MJ： Sudden cardiac death caused by coronary heart disease [J]. Circulation，2012，125：1043-1052.

[2] Mahmoud KD， de Smet BJ， Zijlstra F， Rihal CS， Holmes DR， Jr.： Sudden cardiac death： Epidemiology， circadian variation， and triggers [J]. Curr Probl Cardiol，2011，36：56-80.

[3]Hasan W， Jama A， Donohue T， Wernli G， Onyszchuk G， Al-Hafez B， Bilgen M， Smith PG： Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell ngf synthesis following myocardial infarction in rats[J]. Brain Res，2006，1124：142-154.

[4]Wernli G， Hasan W， Bhattacherjee A， van Rooijen N， Smith PG： Macrophage depletion suppresses sympathetic hyperinnervation following myocardial infarction[J]. Basic research in cardiology，2009，104：681-693.

[5]Gleeson M， Bishop NC， Stensel DJ， Lindley MR， Mastana SS， Nimmo MA： The anti-inflammatory effects of exercise： Mechanisms and implications for the prevention and treatment of disease [J]. Nature reviews Immunology，2011，11：607-615.

[6]Mathur N， Pedersen BK： Exercise as a mean to control low-grade systemic inflammation[J]. Mediators Inflamm，2008，109502.

[7]El-Helou V， Proulx C， Gosselin H， Clement R， Mimee A， Villeneuve L， Calderone A： Dexamethasone treatment of post-mi rats attenuates sympathetic innervation of the infarct region[J]. Journal of applied physiology，2008，104：150-156.

[8]Kemi OJ， Haram PM， Loennechen JP， Osnes JB， Skomedal T， Wisloff U， Ellingsen O： Moderate vs. High exercise intensity： Differential effects on aerobic fitness， cardiomyocyte contractility， and endothelial function[J]. Cardiovascular research，2005，67：161-172.

[9]Cao JM， Fishbein MC， Han JB， Lai WW， Lai AC， Wu TJ， Czer L， Wolf PL， Denton TA， Shintaku IP， Chen PS， Chen LS： Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia[J]. Circulation，2000，101：1960-1969.

[10]Oh YS， Jong AY， Kim DT， Li H， Wang C， Zemljic-Harpf A， Ross RS， Fishbein MC， Chen PS， Chen LS： Spatial distribution of nerve sprouting after myocardial infarction in mice[J]. Heart Rhythm，2006，3：728-736.

[11]Kimura K， Ieda M， Fukuda K： Development， maturation， and transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves[J]. Circulation research，2012，110：325-336.

[12]Zhou S， Chen LS， Miyauchi Y， Miyauchi M， Kar S， Kangavari S， Fishbein MC， Sharifi B， Chen PS： Mechanisms of cardiac nerve sprouting after myocardial infarction in dogs[J]. Circulation research，2004，95：76-83.

[13]Blasing H， Hendrix S， Paus R： Pro-inflammatory cytokines upregulate the skin immunoreactivity for ngf， nt3， nt4 and their receptor， p75ntr in vivo： A preliminary report[J]. Arch Dermatol Res，2005，296：580-584.

[14]Kraljevic J， Marinovic J， Pravdic D， Zubin P， Dujic Z， Wisloff U， Ljubkovic M： Aerobic interval training attenuates remodelling and mitochondrial dysfunction in the post-infarction failing rat heart[J]. Cardiovascular research，2013，99：55-64.

[15]Marshall KD， Muller BN， Krenz M， Hanft LM， McDonald KS， Dellsperger KC， Emter CA： Heart failure with preserved ejection fraction： Chronic low-intensity interval exercise training preserves myocardial o2 balance and diastolic function[J].J Appl Physiol （1985），2013，114：131-147.

[16]Giallauria F， Acampa W， Ricci F， Vitelli A， Torella G， Lucci R， Del Prete G， Zampella E， Assante R， Rengo G， Leosco D， Cuocolo A， Vigorito C： Exercise training early after acute myocardial infarction reduces stress-induced hypoperfusion and improves left ventricular function[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging，2013，40：315-324.

[17]Martinez DG， Nicolau JC， Lage RL， Toschi-Dias E， de Matos LD， Alves MJ， Trombetta IC， Dias da Silva VJ， Middlekauff HR， Negrao CE， Rondon MU： Effects of long-term exercise training on autonomic control in myocardial infarction patients[J]. Hypertension，2011，58：1049-1056.

[18]Ribeiro F， Alves AJ， Teixeira M， Miranda F， Azevedo C， Duarte JA， Oliveira J： Exercise training enhances autonomic function after acute myocardial infarction： A randomized controlled study[J].Portuguese journal of cardiology ： an official journal of the Portuguese Society of Cardiology，2012，31：135-141.

[19]Hautala AJ， Makikallio TH， Kiviniemi A， Laukkanen RT， Nissila S， Huikuri HV， Tulppo MP： Cardiovascular autonomic function correlates with the response to aerobic training in healthy sedentary subjects[J]. American journal of physiology，2003，285：H1747-1752.

[20]Adamopoulos S， Parissis J， Kroupis C， Georgiadis M， Karatzas D， Karavolias G， Koniavitou K， Coats AJ， Kremastinos DT： Physical training reduces peripheral markers of inflammation in patients with chronic heart failure[J]. European heart journal，2001，22：791-797.

[21] [JP3]Pavlov VA， Tracey KJ： The cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. Brain， behavior， and immunity，2005，19：493-499.