張雪梅，王小蘭，任曉梅，丁 鏟，竇亞峰，李 濤，王桂軍，于圣青

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌OmpA/motb蛋白的表達(dá)純化及免疫學(xué)特性分析

張雪梅1,2，王小蘭2，任曉梅2，丁 鏟2，竇亞峰2，李 濤2，王桂軍1，于圣青2

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究對血清1型鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）CH3株的ompA/motb基因核苷酸序列及其蛋白進(jìn)行生物學(xué)信息分析，用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得去除信號肽編碼區(qū)段的ompA/motb基因，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-OmpA/mtob，成功表達(dá)分子量約為55 kDa的重組蛋白rOmpA/motb。Western blot結(jié)果顯示，rOmpA/motb能與血清1、2、10和15型RA陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明rOmpA/motb具有交叉免疫原性。以純化的rOmpA/motb免疫新西蘭大白兔，經(jīng)3次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗體效價為1：256 000；Western blot結(jié)果顯示OmpA/motb兔多抗可與血清1型、2型、10型和15型RA菌株發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，與其他菌株無反應(yīng)性。本研究制備的RA OmpA/motb多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性及特異性，為進(jìn)一步研究OmpA/motb蛋白的免疫學(xué)功能及建立鴨疫里默氏桿菌病的診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

鴨疫里默氏桿菌；rOmpA/motb蛋白；多克隆抗體；免疫學(xué)特性

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）主要感染家鴨、火雞、鵝和其他多種鳥類后引起接觸性高致病性傳染病[1]，1～8周齡雛鴨對RA易感，其中以2～3周齡雛鴨最易感。RA感染呈急性敗血或慢性過程，臨床上主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、干酪樣輸卵管炎等。在我國，郭玉璞[2]首次報道了本病，隨后全國各地相繼有RA感染的報道[3,4]。目前，幾乎所有發(fā)展集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國家均發(fā)現(xiàn)有RA感染[5]。

外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，具有較強(qiáng)的免疫原性且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。前期研究表明，RAOmpA/motb蛋白是血清1、2、10型菌株的一個共同免疫原性蛋白[6]。本研究克隆并表達(dá)了RAompA/motb基因，獲得純化的重組OmpA/motb蛋白，并制備了該蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步建立RA快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實驗動物 本研究所用的菌株及引物詳見表1。原核表達(dá)載體pET-30a（+）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生研究室（以下簡稱本實驗室）保存；8周齡雌性新西蘭大白兔購自中國科學(xué)院斯萊克動物實驗中心。

表1 本研究中所用的菌株及引物Table1 Stains and primers used in this study

1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒、可溶型單組分TMB底物溶液購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA連接酶solution I、限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和SalI購自寶生物工程（大連）有限公司；HisTrap親和層析柱購自GE Healthcare Life Sciences公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自KPL公司；基本型ECL發(fā)光液購自上海圣爾生物科技有限公司。

1.3 RA ompA/motb基因的生物信息學(xué)分析、擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank上發(fā)表的RACH3株ompA/motb基因（locus_tag：M949_1325）序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計ompA/motb開放閱讀框引物，PCR擴(kuò)增RANJ3株、HXb2株和LAG1株的ompA/motb基因后進(jìn)行序列測定。運(yùn)用Signal PV4.1預(yù)測OmpA/motb氨基酸的信號肽，TMHMM工具預(yù)測跨膜區(qū)。

提取RACH3株的全基因組DNA為模板，使用Premix TaqTM擴(kuò)增ompA/motb的基因序列（去除信號肽編碼區(qū)）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，并以BamH I和SalI酶切，回收目的片段與經(jīng)同樣酶切處理pET-30a(+)載體連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliDH5α中，挑取陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行酶切和測序鑒定。

1.4 重組蛋白OmpA/motb的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pET30a-OmpA/motb轉(zhuǎn)入宿主菌BL21（DE3），挑取陽性克隆接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，同時設(shè)置陰性對照。收集菌體，通過高壓破碎法裂解細(xì)菌，離心后收集上清和包涵體，SDSPAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況。

收集誘導(dǎo)表達(dá)rOmpA/motb的細(xì)菌，菌體裂解后收集包涵體，溶于8 mol/L尿素溶解液。溶解后的蛋白用HisTrap親和層析柱進(jìn)行純化。經(jīng)SDS-PAGE分析純度后，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

1.5 OmpA/motb蛋白免疫原性的檢測 采用Western blot檢測OmpA/motb蛋白的免疫原性。誘導(dǎo)表達(dá)rOmpA/motb的細(xì)菌裂解后進(jìn)行SDS-PAGE分析，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。經(jīng)含5%脫脂乳的PBS封閉后，分別與RA血清1、2、10、15型陽性鴨血清及健康陰性鴨血清孵育，再與HRP標(biāo)記羊抗鴨IgG孵育。最后用基本型ECL發(fā)光液顯色，Tanon全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 抗OmpA/motb蛋白多克隆抗體的制備及效價的測定 將500 μg純化后的rOmpA/motb蛋白與等體積弗氏佐劑混合并充分乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。此后每隔2周，取首免等劑量的免疫原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后加強(qiáng)免疫2次。三免后10 d采血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用本實驗室已建立的間接ELISA測定兔血清抗體效價。具體方法如下：用純化的rOmpA/motb、CH3全菌蛋白、NJ3全菌蛋白和HXb2全菌蛋白分別包被ELISA板；經(jīng)含5%脫脂乳的PBS溶液封閉后，依次以2倍倍比稀釋的抗OmpA/motb蛋白兔血清作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，孵育后PBST洗滌，TMB底物顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后測定OD450值。以未免疫兔血清作為陰性對照，當(dāng)陽性血清OD450與陰性血清OD450之比，即（P/N）≥2.1，判定為陽性。

1.7 抗OmpA/motb蛋白多克隆抗體的特異性檢測 取RA血清1型、血清2型、血清10型、血清15型菌株（CH3、NJ3、HXb2、LAG1）、禽致病性大腸桿菌血清O1型菌株APECO1、血清O2型菌株DE719、血清O78型菌株E937、沙門氏菌菌株CVCC1805、CAU0118和禽巴氏桿菌菌株CVCC493，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，4℃、12 000×g離心5 min，收集菌體，PBS洗滌后重懸（2.0×109CFU/mL）于1×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液中，煮沸獲得各菌株的全菌蛋白。對提取的全菌蛋白和純化的rOmpA/motb蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，半干轉(zhuǎn)印至NC膜上；用含5%脫脂乳的PBS封閉后，以抗OmpA/motb蛋白兔血清為一抗；IRDye?800CW標(biāo)記的驢抗兔IgG為二抗，分析抗OmpA/motb蛋白兔血清的特異性。

2 結(jié)果

2.1 ompA/motb基因的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用ompA/motb基因特異性引物可從RACH3株、NJ3株、HXb2株和LAG1株中擴(kuò)增到ompA/motb基因，經(jīng)序列測定其片段長度均為1467 bp。序列分析表明RACH3株的ompA/motb基因與NJ3株、HXb2株和LAG1株的基因具有很高的同源性，其核苷酸序列相似性為95.8%～98.8%，編碼產(chǎn)物氨基酸序列相似性為96.7%～99.2%。經(jīng)預(yù)測OmpA/motb蛋白有Tsp-3和OmpA-C-Like 2個保守區(qū)；有一個N端信號肽，位于1-21號氨基酸殘基；無跨膜區(qū)。

2.2 融合表達(dá)載體pET30a-OmpA/motb的構(gòu)建 以RACH3株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期1374 bp大小一致的ompA/motb基因去信號肽片段（圖1A）；克隆至載體pET-30a(+)后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-OmpA/motb，PCR鑒定獲得2株陽性克?。▓D1B）；重組質(zhì)粒pET30a-OmpA/motb經(jīng)雙酶切鑒定，獲得與理論值一致的目的條帶（圖1C）。測序結(jié)果顯示，重組載體中的ompA/motb基因序列完全正確，表明重組載體pET30a-OmpA/motb構(gòu)建成功。

圖1 重組載體pET30a-OmpA/motb的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant pET30a-OmpA/motb

2.3 rOmpA/motb的原核表達(dá)、純化及抗原性分析將誘導(dǎo)的菌體裂解，分離上清和沉淀后進(jìn)行SDSPAGE分析。結(jié)果表明，rOmpA/motb在55 kDa左右出現(xiàn)目的條帶，且重組蛋白以包涵體形式存在（圖2A）。經(jīng)親和層析柱純化后，獲得了較高純度的rOmpA/motb，濃度為2.0 mg/mL。

對rOmpA/motb的免疫原性進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，重組蛋白能夠與RA血清1、2、10型及15型陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在55 kDa處出現(xiàn)單一特異性目的帶（圖2B），表明OmpA/motb蛋白具有良好的交叉免疫原性。

2.4 兔抗rOmpA/motb多克隆抗體的效價測定 運(yùn)用間接ELISA方法檢測rOmpA/motb免疫新西蘭大白兔后獲得的高免血清，結(jié)果顯示，第3次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗體效價為1:256 000；而且可與血清1、2、10型RA（CH3、NJ3、HXb2）發(fā)生良好的交叉反應(yīng)（圖3），表明成功獲得了高效且具有交叉反應(yīng)性的RA OmpA/motb兔多抗。

2.5 兔抗OmpA/motb多克隆抗體的特異性檢測Western blot分析表明，RAOmpA/motb兔多抗可與血清1、2、10型和15型RA（CH3、NJ3、HXb2和LAG1）發(fā)生特異性交叉反應(yīng)，與禽致病性大腸桿菌（APECO1、DE719、E937）、沙門氏菌（CVCC1805、CAU0118）、禽巴氏桿菌（CVCC493）不發(fā)生反應(yīng)（圖4），表明制備的RAOmpA/motb多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性及特異性。

圖2 RA OmpA/motb蛋白的原核表達(dá)、純化及抗原性分析Fig.2 Expression, puri fi cation and speci fi city of RA OmpA/motb protein

3 討論

OMPs在細(xì)菌的生命過程中起著重要的作用。OMPs具有良好的免疫原性，可同時激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護(hù)作用，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原。前期研究表明，OmpA/motb蛋白是RA血清1、2、10型的一個共同免疫原性蛋白[6]。本研究成功擴(kuò)增了RA的ompA/motb基因，并利用pET-30a（+）表達(dá)載體成功獲得rOmpA/motb，該蛋白能與不同血清型RA陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，表明OmpA/motb具有交叉免疫原性。rOmpA/motb免疫新西蘭大白兔后獲得的高免血清能夠與血清1、2、10型及15型RA菌株發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與禽致病性大腸桿菌、沙門氏菌和禽巴氏桿菌發(fā)生反應(yīng)，表明制備的RAOmpA/motb多克隆抗體具有良好特異性。

圖3 鴨疫里默氏桿菌OmpA/motb多克隆抗體的ELISA效價Fig.3 The ELISA titer of the rabbit anti-OmpA/motb antibody

圖4 OmpA/motb多克隆抗體的Western blot鑒定Fig.4 Identi fi cation of rabbit anti-OmpA/motb antibody by Western blot analysis

研究表明，ompA是不同血清型RA菌株的保守基因[10]，楊建遠(yuǎn)等[11]以ompA基因建立的PCR檢測方法可以檢測出多種血清型RA菌株。對RAompA/motb基因的序列分析表明，該基因編碼產(chǎn)物OmpA/motb在RA中高度保守，而與大腸桿菌、沙門氏菌等的OmpA蛋白和Motb蛋白的相似性很低；且OmpA/motb蛋白能與不同血清型RA陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因此OmpA/motb可以作為RA血清學(xué)診斷的一個診斷靶標(biāo)。

目前，臨床上檢測RA的方法有病原菌的分離鑒定、凝集試驗或瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗的血清學(xué)方法以及PCR診斷的分子生物學(xué)方法等，這些方法存在程序繁瑣、靈敏性低、成本較高等缺點(diǎn)，因此需要建立一種快速靈敏、特異性強(qiáng)的方法以滿足快速診斷檢測的要求。本研究獲得的RAOmpA/motb兔多抗反應(yīng)性好、特異性強(qiáng)，可用于研制具有高靈敏性和特異性膠體金免疫檢測試劑盒，以實現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌病的快速檢測及鑒別診斷。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT RIEMERELLA ANATIPESTIFER OMPA/MOTB PROTEIN

ZHANG Xue-mei1,2, WANG Xiao-lan2, REN Xiao-mei2, DING Chan2, DOU Ya-feng2, LI Tao2,WANG Gui-jun1, YU Sheng-qing2

(1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The OmpA/motb domain protein (OmpA/motb) has been identi fi ed as an immunogenic antigen of Riemerella anatipestifer by using immunoproteomics analysis. In this study, OmpA/motb of R. anatipestifer was expressed and recombinant protein was evaluated for its immunogenicity. The ompA/motb gene was ampli fi ed from serotype 1 strain CH3 of R. anatipestifer by polymerase chain reaction(PCR) and cloned into expression vector pET-30a (+). The pET30a-OmpA/motb plasmid was constructed and transformed into E. coli strain BL21(DE3). The recombinant OmpA/motb (rOmpA/motb) was expressied in E.coli with induction of IPTG and con fi rmed to be a recombinant protein of 55 kDa in SDS-PAGE with Coomassie blue staining. The recombinant protein rOmpA/motb reacted with duck antisera against R. anatipestifer CH3, NJ3, HXb2 and LAG1 in Western blot, suggesting it was a cross-immunogenic protein among R.anatipestifer strains of different serotypes. Subsequently, rabbit anti-OmpA/motb antibodies were generated by immunization of rabbits with purified rOmpA/motb. The titer of antiserum was assessed to be over 1：256 000 in ELISA. The rabbit anti-OmpA/motb serum reacted with R. anatipestifer CH3, NJ3, HXb2 and LAG1 in Western blotting but did not react with avian pathogenic E. coli, Salmonella enterica and Pasteurella multocida strains. The results showed that rabbit anti-OmpA/motb serum was speci fi c to and cross-reactive with R.anatipestifer strains of serotypes 1, 2, 10 and 15, suggesting it might be used for developing diagnostic kits in the further study.

Riemerella anatipestifer; rOmpA/motb; polyclonal antibody; immunologicity

S852.615

A

1674-6422（2018）01-0037-06

2017-08-18

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0500800）

張雪梅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn；王桂軍，E-mail：wangguijun@ahau.edu.cn