張文超，虞凌雪，姜一峰，高 飛，黃勤峰，李麗薇，李慧春，陳鵬飛，楊德強(qiáng)，劉 歡，童光志，杜雅楠，周艷君

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP12蛋白的表達(dá)與鑒定

張文超1,2，虞凌雪2，姜一峰2，高 飛2，黃勤峰2，李麗薇2，李慧春2，陳鵬飛2，楊德強(qiáng)2，劉 歡2，童光志2，杜雅楠1，周艷君2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究擴(kuò)增了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HuN4株的NSP12基因，將其克隆于pCold-I載體中，獲得重組質(zhì)粒pCold-I-NSP12，并轉(zhuǎn)化于E.coli/BL21感受態(tài)細(xì)胞，在16℃條件下用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)20 h后，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示在大約18 kDa處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白。用PRRSV特異性陽(yáng)性豬血清對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示該蛋白可以被PRRSV陽(yáng)性豬血清識(shí)別。將重組NSP12蛋白純化后，免疫6周齡BALB/c小鼠制備多克隆抗體。在MARC-145細(xì)胞中，對(duì)獲得的NSP12多抗血清分別進(jìn)行Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immuno fl uorescence assay，IFA）鑒定，結(jié)果顯示本研究制備的NSP12多抗血清均可與感染的MARC-145細(xì)胞的PRRSV HuN4株以及在MARC-145細(xì)胞中特異表達(dá)的NSP12蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。PRRSV NSP12蛋白的表達(dá)及其多克隆抗體的制備為進(jìn)一步研究NSP12在病毒感染過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；NSP12；原核表達(dá)；多抗

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。PRRSV在1987年于美國(guó)首次報(bào)道[2]，感染后臨床癥狀主要為發(fā)燒、呼吸困難、耳朵發(fā)紺、厭食、肺損傷和流產(chǎn)等[3]。PRRS至今仍是全球養(yǎng)豬業(yè)的重要威脅[4]。PRRSV基因組全長(zhǎng)約15 kb，包含ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF7等10個(gè)開(kāi)放性閱讀框（open read frame，ORF）。其中ORF1a和ORF1b編碼復(fù)制多聚蛋白pp1a和pp1ab，而復(fù)制多聚蛋白可進(jìn)一步被自剪切成NSP1～NSP12一系列非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，NSP）。目前已有研究證實(shí)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP4、NSP11都有抑制I型干擾素表達(dá)的作用[5]，其中NSP2突變頻率較高，對(duì)病毒的復(fù)制有重要作用[6]；NSP9是PRRSV中高度保守的RNA依賴的RNA聚合酶[7]，主要參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程；NSP10是解旋酶；NSP11是核酸內(nèi)切酶[8]。有研究認(rèn)為Nsp9和Nsp10是HP-PRRSV毒力相關(guān)主要基因[9]。關(guān)于NSP12功能研究相對(duì)較少。Yu等[10]研究證明NSP12可以使轉(zhuǎn)錄激活因子727位絲氨酸（pSTAT1-S727）磷酸化增加，且誘導(dǎo)IL-1β和IL-8的表達(dá)，但抑制機(jī)制尚未解析。王蓉等[11]研究認(rèn)為NSP12、GP3和N蛋白對(duì)干擾素刺激應(yīng)答元件（ISRE）啟動(dòng)子有抑制作用，這幾個(gè)蛋白的共同作用可以抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒作用，從而為病毒復(fù)制獲得時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)證實(shí)NSP12蛋白能夠抑制IFN-β的表達(dá)，但其作用機(jī)理尚未完全明確[12]。為了進(jìn)一步探討NSP12蛋白的功能，本研究對(duì)NSP12蛋白進(jìn)行了表達(dá)并制備特異性多抗，為后期研究NSP12蛋白在病毒感染中的作用提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體與試驗(yàn)動(dòng)物 PRRSV HuN4株、PRRSV陽(yáng)性豬血清和真核表達(dá)載體pCAGGS-NSP12由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；冷休克表達(dá)載體pCold-Ⅰ購(gòu)自TaKaRa公司；6周雌性BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克公司。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自Thermo公司；EX Taq購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoR I購(gòu)自NEB公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司；HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.3 NSP12基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中PRRSV HuN4株核苷酸序列（登錄號(hào)：EF635006）[13]，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)NSP12基因的特異性引物（表1）。提取PRRSV HuN4株基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，利用合成的NSP12-F/NSP12-R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 HP-PRRSV NSP12引物序列Table 1 Primers designed to amplify the HP-PRRSV Nsp12 gene

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 膠回收RT-PCR擴(kuò)增獲得的PCR片段，經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切后連接至經(jīng)同樣雙酶切處理的冷休克表達(dá)載體pCold-I，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coli/BL21感受態(tài)菌株中，經(jīng)挑菌、搖菌，提質(zhì)粒，表達(dá)載體分別進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定和質(zhì)粒測(cè)序鑒定（由上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證）。

1.5 蛋白的表達(dá)與鑒定 將陽(yáng)性重組菌株接種于含有氨 抗性的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD260為0.6～1.0，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在16℃恒溫振蕩誘導(dǎo)不同時(shí)間，分別收獲誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)最佳誘導(dǎo)條件；將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂乳室溫封閉3 h，利用1∶5000稀釋的抗PRRSV陽(yáng)性豬血清作為一抗，1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法顯色觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.6 NSP12蛋白多抗的制備及鑒定 利用BCA濃度試劑盒測(cè)定純化后的NSP12蛋白濃度，按100 μg/只的劑量與等量弗氏佐劑乳化，按常規(guī)小鼠免疫小時(shí)程序免疫6周齡BALB/c小鼠。經(jīng)3次免疫后，采集并分離免疫鼠血清。分別利用PRRSV HuN4株感染48 h后的MARC-145細(xì)胞和將真核載體pCAGGS-NSP12轉(zhuǎn)染48 h后的MARC-145細(xì)胞，經(jīng)80%的冷乙醇固定后，對(duì)制備的NSP12多抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofluorescence assay，IFA）。同時(shí)分別提取HuN4株感染的MARC-145細(xì)胞總蛋白，以及真核載體pCAGGS-NSP12轉(zhuǎn)染的MARC-145細(xì)胞總蛋白，對(duì)制備的NSP12多抗進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 pCold-NSP12表達(dá)載體的鑒定 以PRRSV HuN4株的cDNA為模板，利用特異性引物NSP12-F/NSP12-R擴(kuò)增NSP12基因，結(jié)果顯示，可以擴(kuò)增出大小約為480 bp左右的目的片段。將其克隆至pCold I載體中，經(jīng)XhoI/EcoR I雙酶切酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)?？梢员幻盖谐纱笮〖s為480 bp和4400 bp左右的兩個(gè)片段，且測(cè)序結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)基因序列完全一致，將獲得陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒命名為pCold-NSP12。

2.2 NSP12蛋白的表達(dá)與鑒定 將陽(yáng)性菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在大約18 kDa的位置出現(xiàn)特異性蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，且該蛋白誘導(dǎo)36 h后表達(dá)量較高（圖1）。將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC膜上，利用抗PRRSV陽(yáng)性豬血清作為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，抗PRRSV陽(yáng)性豬血清能夠特異性識(shí)別表達(dá)NSP12蛋白（圖2）。

圖1 NSP12重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.1 Prokaryotic expression and puri fi cation of the recombinant NSP12 protein

圖2 pCold-NSP12免疫原性的檢測(cè)Fig.2 Detection of recombinant NSP12 protein by Western blot

2.3 NSP12多抗的IFA鑒定 以表達(dá)純化后的NSP12蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)3次免疫后制備抗NSP12蛋白的多抗。利用抗NSP12蛋白的多抗對(duì)PRRSV HuN4株感染48 h后的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示該多抗可以特異性識(shí)別HuN4株感染的MARC-145細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定該多抗白多抗分別對(duì)PRRSV HuN4株感染的MARC-145細(xì)胞和真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-NSP12轉(zhuǎn)染的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，在大約18 kDa左右均可檢測(cè)到特異性蛋白條帶，表明該多抗可以特異性識(shí)別PRRSV所表達(dá)的NSP12蛋白（圖4）。的特異性，利用抗NSP12蛋白的多抗對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-NSP12轉(zhuǎn)染48 h后的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，該多抗可以特異性識(shí)別pCAGGS-NSP12轉(zhuǎn)染的MARC-145細(xì)胞（圖3）。

圖3 抗NSP12蛋白多抗的IFA鑒定Fig.3 Detection the expression of NSP12 with the pAbs using IFA

2.4 NSP12多抗的Western blot鑒定 利用抗NSP12蛋

3 討論

PRRSV是有囊膜的、單股正鏈RNA病毒[14]，PRRSV感染具有免疫抑制和持續(xù)感染的特性[15]，其原因可能是病毒感染會(huì)對(duì)干擾素信號(hào)通路產(chǎn)生抑制，進(jìn)而抑制宿主天然免疫，延遲中和抗體的產(chǎn)生，從而使病毒難以清除，造成持續(xù)感染。NSP12蛋白作為PRRSV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能尚不完全清楚。有研究人員運(yùn)用高通量測(cè)序的方法篩選并鑒定出PRRSV在其感染的靶細(xì)胞—豬肺泡巨噬細(xì)胞中與NSP12相互作用的蛋白HSP70，經(jīng)分析認(rèn)為NSP12可能與病毒復(fù)制有關(guān)[16]。同時(shí)在對(duì)與PRRSV病毒同屬的馬動(dòng)脈炎病毒（Equine Arteritis virus，EVA）的研究中顯示，NSP12對(duì)病毒的復(fù)制具有重要作用[17]。為了進(jìn)一步探索PRRS病毒NSP12蛋白在病毒感染中的作用，本研究利用pCold-I載體成功地表達(dá)了NSP12蛋白。Western blot顯示，表達(dá)的蛋白可被PRRSV豬陽(yáng)性血清識(shí)別，表明其具有較好的免疫原性。在低溫誘導(dǎo)的條件下，NSP12蛋白可以獲得高效表達(dá)，其中少量呈可溶性表達(dá)，大部分是以包涵體的形式存在。將表達(dá)的蛋白經(jīng)尿素溶解變性和透析復(fù)性后，可獲得高純度的NSP12蛋白。為了進(jìn)一步確定該蛋白的活性，將純化后的蛋白免疫小鼠，制備了針對(duì)PRRSV NSP12的多抗。經(jīng)Western blot和IFA檢測(cè)證實(shí)該多抗可以識(shí)別病毒在感染MARC-145細(xì)胞中表達(dá)的NSP12蛋白，也能識(shí)別單基因真核表達(dá)的NSP12蛋白。本研究表達(dá)的NSP12蛋白抗原性較好，獲得的多抗特異性強(qiáng)，可以作為今后開(kāi)展對(duì)NSP12蛋白功能研究的輔助工具。

圖4 NSP12蛋白多抗的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of the anti-NSP12 polyclonal antibody

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND IDENTIFICATION OF NONSTRUCTURAL PROTEIN 12 OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS

ZHANG Wen-chao1,2, YU Ling-xue2, JIANG Yi-feng2, GAO Fei2, HUANG Qin-feng2, LI Li-wei2,LI Hui-chun2, CHEN Peng-fei2, YANG De-qiang2, LIU Huan2, TONG Guang-zhi2, DU Ya-nan1,ZHOU Yan-jun2

(1. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The non-structural protein12 (NSP12) of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was ampli fi ed and cloned into the pCold-I vector. The recombinant plasmid pCold-Nsp12 was then transformed into E.coli/BL21 cells and induced with 1 mmol/L isopropyl β -D-thiogalactoside (IPTG) at 16℃ for 20 h. The recombinant protein was purified and identified with SDS-PAGE as about 18kDa band and also recognized in Western blotting using PRRSV antisera. Subsequently, the purified recombinant Nsp12 protein was administered into 6-week-old BALB/c mice for production of polyclonal antibodies. The antisera collected from these immunized mice speci fi cally reacted with PRRSV HuN4 strain and NSP12 protein expressed in MARC-145 in IFA and Western blotting.The present study laid a basis for further study on the role of NSP12 in PRRSV infection.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, NSP12, prokaryotic expression, polyclonal antibody

S852.659.6

A

1674-6422（2018）01-0032-05

2017-03-22

973 計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB542702）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2015BAD12B01-1）；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

張文超，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

周艷君，E-mail：yjzhou@shvri.ac.cn；杜雅楠，E-mail：yanandu@126.com