周笑犁，吳珊珊，林棟，杜斌，陳敏，張婷

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550005）

在生物體內(nèi)，活性氧和抗氧化防御系統(tǒng)總是處在一個動態(tài)平衡的過程中，一旦這個平衡被破壞，那些具有高反應(yīng)活性的活性氧基團能夠直接造成人體生物膜系統(tǒng)的損傷，從而導(dǎo)致正常細胞的裂解死亡[1-2]；過剩的自由基還會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激現(xiàn)象，氧化體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等[3]，抗氧化物質(zhì)則能在一定程度上保護生物機體免遭活性氧基團的破壞。藍莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）植物，主要分布于我國山東、吉林、遼寧、江蘇、貴州等地區(qū)；據(jù)報道藍莓果實能夠減緩衰老，預(yù)防腦神經(jīng)老化，增強記憶力，預(yù)防心血管病，增強自身免疫力等功效[4-6]。藍莓果實中含有豐富的花色苷、多酚，它們作為一種良好的抗氧化劑，能有效抑制氧自由基的產(chǎn)生或清除氧自由基，已有較多的研究證明了其活性[7-8]。

近年來，利用體外消化模型研究生物活性物質(zhì)越來越受到國內(nèi)外的關(guān)注。相對于研究物質(zhì)體內(nèi)的消化，體外模擬消化是一種較為簡單、有效的模擬消化過程，不僅可以在某種程度上反映物質(zhì)在體內(nèi)的變化情況，而且體外研究法消耗財力少，還具有易于操控等優(yōu)勢[9-10]。但目前關(guān)于藍莓果實中活性物質(zhì)在體內(nèi)消化過程中的變化情況我們還了解甚少，特別是對于富含活性成分的果皮渣這一加工副產(chǎn)物。本文嘗試通過體外模擬胃腸消化方法，評價藍莓果皮渣粗提物在消化過程中活性物質(zhì)的變化規(guī)律，及其抗氧化活性，以期對藍莓及其加工副產(chǎn)物的抗氧化活性進行更全面科學(xué)的評價，為藍莓加工副產(chǎn)物-果皮渣在醫(yī)藥、營養(yǎng)及保健食品中的應(yīng)用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

藍莓皮渣干粉是在貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心經(jīng)藍莓鮮果制作果汁后所剩的皮渣副產(chǎn)物，再經(jīng)干燥粉碎；α-淀粉酶（3 700 U/g，生化試劑）、胃蛋白酶（3 000 U/g，生化試劑）、胰酶（4 000 U/g，生化試劑）：上海金穗生物科技有限公司；膽汁（生化試劑）：Ruibio；氯化鈣、氯化鉀、福林酚、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、碳酸鈉、硝酸鋁、碳酸氫鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；TDL-16RH離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；烘箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁；SHB-III循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：常州澳華恩斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓皮渣粗提物

稱取50 g的藍莓皮渣干粉，用100 mL 95%乙醇-0.1%HCl溶液（1∶1，體積比）作為提取液，在40℃下超聲提取，冷卻后進行抽濾，再將濾渣進行重提兩次，合并濾液即為皮渣粗提物。

1.3.2 體外模擬消化[11]

體外模擬消化試驗，包含體外模擬胃消化和腸消化兩部分。體外模擬腸消化是在唾液和胃消化的基礎(chǔ)上，再進行腸消化。

1.3.2.1 消化液的配制[9-10]

體外模擬胃液：稱取135mg胃蛋白酶（3000U/mL）加入500 mL胃電解質(zhì)溶液，混合均勻，用1 mol/L HCl調(diào)pH值至2。

體外模擬腸液：向90 mL腸電解質(zhì)溶液中加入90 mL胰酶和膽汁溶液，搖晃均勻，用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7。

胃電解質(zhì)溶液：稱取 3.1 g NaCl、1.1 g KCl、0.15 g CaCl2、0.6 g NaHCO3用去離子水溶解并定容至1 L。

腸電解質(zhì)溶液：稱取 5.4 g NaCl、0.65 g KCl、0.33 g CaCl2用去離子水溶解并定容至1 L。

1.3.2.2 模擬胃消化

取一定量藍莓皮渣粗提物，分別稀釋2、5、10倍，即為高、中、低濃度粗提液。分別取3種濃度的粗提液加入α-淀粉酶/CaCl2溶液（模擬唾液），混合均勻，在37℃水浴恒溫振蕩器里消化10 min；然后加入體外模擬胃液（對照組為不添加胃蛋白酶的胃電解質(zhì)溶液），并調(diào)節(jié)樣品組和對照組pH2.0，避光于37℃和100 r/min搖床中模擬胃消化培養(yǎng)，分別在消化0.5、1、2 h后取樣品，6 000 r/min下離心10 min，取上清液于-20℃凍存，以備后面分析用。

1.3.2.3 模擬腸消化

經(jīng)過唾液和胃消化后的消化液中加入體外模擬腸液（對照組為不添加胰酶和膽汁的腸電解質(zhì)溶液），此時即為模擬腸消化前。然后用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)樣品組和對照組pH值至7.2，繼續(xù)置于100 r/min，37℃的搖床中模擬腸消化培養(yǎng)，分別在消化 0.5、1、2、3、4 h后取樣品，在6 000 r/min下離心10 min，取上清液于-20℃凍存，以備后面分析用。

1.3.3 消化液抗氧化成分分析

1.3.3.1 花色苷含量的測定[8]

將消化液分別用NaAc緩沖液和KCl緩沖液稀釋，于黑暗處靜置20 min后在分光光度計上分別測定樣品在510 nm和710 nm處的吸光度進行計算：A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；則粗提物樣品液中花色苷的濃度為：C/（mg/mL）=（A×MW×DF）/（ε×1）。

式中：MW為樣品中主要花色苷的分子量，MW=449.2；DF為稀釋因子；ε為樣品中主要花色苷的摩爾吸收率，ε=26 900。

1.3.3.2 多酚含量測定

參考福林法[8]，移取模擬胃、腸消化液1 mL于比色管中，各加入福林酚試劑3 mL，搖勻后避光放置30 s，再各加入12%Na2CO3溶液6.0 mL，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在760 nm處測定吸光度。

1.3.3.3 黃酮的測定

取0.5 mL模擬胃、腸消化液，各加入0.4 mL 5%Na2CO3溶液，搖勻，放置5 min后加入0.4 mL的10%Al（NO3）3溶液，定容至10 mL。室溫下放置15 min，在波長510 nm處測定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量[12]。

1.3.4 消化液抗氧化活性分析

1.3.4.1 還原能力的測定

采用普魯士藍法[13]，移取1 mL模擬胃、腸消化液，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）2.5 mL和質(zhì)量分數(shù)1%六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL，放入50℃水浴20 min，快速冷卻，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min下離心10 min，移取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分搖勻，靜置10 min后，在波長為700 nm處測定其吸光值。

1.3.4.2 清除羥自由基（·OH）活性

在帶塞試管中依次加入2 mL 9 mmol/L FeSO4、2 mL 9 mmol/L水楊酸和3 mL模擬胃、腸消化液，最后分別加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，在37℃水浴中反應(yīng)1 h，于波長510 nm處測量吸光值[14]，清除率/%=[A0-（Ai-Ai0）]/A0×100。

式中：A0為樣品濃度為0 mg/mL時的吸光值；Ai為加入樣品時的吸光值；Ai0為對應(yīng)樣品中無顯色劑時的吸光值。

1.3.5 試驗數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化過程中藍莓皮渣粗提物抗氧化成分的變化

2.1.1 花色苷

藍莓皮渣粗提物模擬胃腸道消化過程中花色苷含量的變化如圖1所示。

圖1 體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物花色苷釋放量的影響Fig.1 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on anthocyanin released from digested crude extract of blueberry pomace

由圖1可知，較消化前，不同濃度的粗提物經(jīng)胃消化后花色苷均有了顯著的提高（p＜0.05）；在模擬胃消化過程中，花色苷含量均顯著增加再減少，在胃消化30 min時各組含量呈現(xiàn)最大峰值；并比相應(yīng)濃度的對照組（未加胃蛋白酶消化）花色苷含量也顯著增加（p＜0.05），而3個不同劑量的對照組花色苷釋放量在模擬消化前后均無顯著變化（p＞0.05）。

模擬胃消化2 h結(jié)束后進行腸消化，各組花色苷含量迅速且顯著降低（p＜0.05），直到模擬腸道環(huán)境消化2 h左右，高、中、低濃度的粗提物花色苷含量輕微增加，但均低于消化前的含量，且隨著消化時間的延長又逐漸減少，而3個不同劑量的對照組花色苷釋放量在模擬腸道消化前后均顯著減少（p＜0.05）。藍莓皮渣粗提物在模擬胃環(huán)境中花色苷含量的提高可能是胃蛋白酶消化的酸性環(huán)境（pH2.0）引起的，在該環(huán)境下添加的酶促進了花色苷的釋放，可能花色素與蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下水解從而失去了束縛被釋放；而對照組中花色苷由于酸性條件下較為穩(wěn)定，變化不顯著（p＞0.05）；但在模擬腸道環(huán)境中花色苷含量有所降低可能由于所存在的一些酶或是pH值變化使得花色苷含量和存在形式發(fā)生變化。有研究表明葡萄在腸胃消化后會損失90%的花色苷[15]，而楊梅最高會損失59.3%[16]，這與本試驗的結(jié)果較一致，藍莓皮渣粗提物經(jīng)胃消化后其中花色苷可增加一倍，而經(jīng)腸道消化后比消化前損失了近50%，與其他幾種活性成分相比，花色苷在胃腸消化后的損失更加顯著。

2.1.2 多酚

多酚化合物普遍存在于水果、蔬菜、堅果和谷物中[17]，是廣泛存在于植物中的次級代謝產(chǎn)物，可以有效清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，具有抗氧化、抗菌等多種生物活性[18－19]。模擬胃腸道消化過程中藍莓皮渣粗提物多酚含量的變化如圖2所示。

圖2 體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物多酚釋放量的影響Fig.2 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on phenolics released from digested crude extract of blueberry pomace

由圖2可知，3組不同劑量的粗提物經(jīng)胃消化后多酚含量呈先上升，在30 min時其含量達到最大，隨之含量略有下降并趨于穩(wěn)定；模擬胃消化過程中高、中、低濃度提取物組多酚的最大釋放量分別為胃消化0 h的 2.8、3.9、4.3倍（p＜0.05）；對照組的多酚含量在模擬胃消化2.0 h內(nèi)的變化沒有顯著性差異（p＞0.05），表明胃蛋白酶的消化使藍莓皮渣粗提物中的多酚物質(zhì)進一步釋放出來。李俶報道了由于酚類化合物單體之間形成一定的相互作用，增加了其在胃腸液內(nèi)的穩(wěn)定性[20]。在黑枸杞體外消化過程中發(fā)現(xiàn)酶解和pH值的變化更能夠讓酚酸從結(jié)合態(tài)分解為自由態(tài)[11]。

而經(jīng)模擬腸道消化時，藍莓皮渣粗提物中多酚隨著消化時間的增加而逐漸增大，高、中濃度組在2 h～3 h時達到最大后趨于穩(wěn)定，而低劑量組則較早（1 h～2 h）達到最大多酚量后趨于穩(wěn)定。在胃消化和腸消化階段藍莓皮渣多酚比消化前和對照組均顯著增加（p＜0.05），可能是模擬消化液中的消化酶（淀粉酶、胃蛋白酶與胰酶）逐步破壞了食物基質(zhì)的細胞壁，促進了游離酚類的逐步釋放[21－22]。至于腸消化階段的多酚含量較胃消化階段顯著降低，這與麩皮體外消化多酚的變化情況較一致，卻不同于全麥和精面多酚的釋放規(guī)律[2]；也有關(guān)于葡萄進行體外消化的研究發(fā)現(xiàn)，酚酸、花青素和白藜蘆醇在腸液條件下降解[3，15]。因此在本試驗?zāi)c道模擬消化環(huán)境，胰酶可能繼續(xù)使結(jié)合態(tài)多酚釋放為游離態(tài)，但酚酸和花青素對消化酶或者腸道環(huán)境敏感產(chǎn)生不穩(wěn)定而發(fā)生降解，因而腸液消化組的多酚含量沒有表現(xiàn)出明顯的增加。

2.1.3 黃酮

體外模擬胃腸消化過程中藍莓皮渣粗提物黃酮釋放量的變化情況如圖3所示。

圖3 體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物黃酮釋放量的影響Fig.3 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on flavonoid released from digested crude extract of blueberry pomace

與模擬胃消化0 h相比，3組不同劑量藍莓皮渣粗提物的黃酮釋放量在0.5 h內(nèi)顯著升高（p＜0.05），隨之下降，可能是隨著消化時間的延長，穩(wěn)定性差的組分發(fā)生了降解，消化1 h后黃酮釋放量趨于穩(wěn)定，對照組的黃酮釋放量在模擬胃消化過程中也有一定的增加，這表明胃蛋白酶和胃酸對黃酮的釋放均具有一定的作用，這與芒果、蘋果中黃酮經(jīng)胃消化后的釋放趨勢一致[3，23]。

經(jīng)模擬腸道環(huán)境消化后，腸消化組中藍莓皮渣粗提物的黃酮含量逐漸上升，2 h后黃酮含量達最大值，是胃0 h黃酮含量的4.63倍，是腸消化前（胃消化反應(yīng)但未進行腸消化）的3.2倍?？瞻捉M的黃酮含量在模擬腸消化過程中無顯著變化（p＞0.05），表明在模擬腸消化過程中，黃酮類植物化學(xué)物釋放增加的主要貢獻來自胰酶和膽汁的作用。黃酮類物質(zhì)也屬于多酚中具有抗氧化活性很高的一類物質(zhì)，而本試驗中黃酮的變化和多酚略有差異，說明在體外消化過程中，不同的多酚物質(zhì)在pH值和酶的作用下發(fā)生了不同的變化。并且黃酮與上述兩種活性成分在模擬胃腸道的釋放量相比，在腸道環(huán)境中更為穩(wěn)定。

2.2 體外模擬消化過程中藍莓皮渣粗提物抗氧化活性的變化

2.2.1 還原能力

體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物還原能力的影響見圖4。

圖4 體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物還原能力的影響Fig.4 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on reducing power from digested crude extract of blueberry pomace

從圖4可以看出，藍莓皮渣粗提物在模擬胃消化后，其還原能力在初始消化的30 min最大，隨著胃消化時間的延長，其還原能力逐漸下降，尤其是高濃度組在30 min時的還原能力顯著高于消化1 h和2 h，也顯著高于其他各組（p＜0.05）。模擬腸道消化環(huán)境中，隨著消化時間的延長，各組還原能力呈先增加再減少，在消化2 h～3 h時，各組樣品均能呈現(xiàn)較強的還原能力；模擬腸道消化的藍莓皮渣粗提物的還原能力均低于模擬胃液中的還原能力。這可能與胃消化后藍莓皮渣粗提物中花色苷、多酚的含量顯著增加有關(guān)，而腸道環(huán)境處于中性使得花色苷等活性成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致活性的降低。無論在模擬胃液或模擬腸液中，隨著藍莓皮渣粗提物濃度的下降，其還原能力也隨之減小。

2.2.2 清除羥自由基能力

體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物羥自由基的影響見圖5。

從圖5可以看出，模擬胃腸道消化過程中，高濃度提取物組的羥自由基清除率均高于低濃度組。藍莓皮渣粗提物胃液消化組羥自由基清除率在消化0.5 h內(nèi)達到最大，在消化1 h～2 h保持穩(wěn)定，這和其他抗氧化成分的變化基本一致；藍莓皮渣粗提物經(jīng)胃腸消化組分的抗氧化能力提高，其原因可能與經(jīng)胃腸消化后組分中多酚和花色苷含量的顯著增加有關(guān)。模擬人體腸環(huán)境中，各組羥自由基清除率有所降低，消化過程中呈先上升，2 h后基本趨于平緩的變化趨勢，可能經(jīng)過模擬人體腸環(huán)境處理后花色苷、多酚等活性成分發(fā)生大量損失使得活性降低；抗氧化活性是所有活性成分發(fā)揮協(xié)同和拮抗作用的結(jié)果，胃腸環(huán)境的變化可能影響了活性成分的結(jié)構(gòu)和相互作用[3]。

圖5 體外模擬胃腸消化對藍莓皮渣粗提物羥自由基的影響Fig.5 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on the hydroxyl free radical scavenging activity from digested crude extract of blueberry pomace

3 結(jié)論

消化系統(tǒng)是生物體的營養(yǎng)攝入系統(tǒng)，食物與消化液之間的相互作用極其復(fù)雜。從一方面來說，消化液會破壞細胞結(jié)構(gòu)，促進食物中活性物質(zhì)的釋放；從另一方面來講，消化液同時也會對活性物質(zhì)本身造成一定程度的破壞[2-3，21]。由于研究胃腸道消化吸收對食物的影響存在很多困難，因此通過體外模擬胃腸道消化成為研究食品在胃腸消化吸收常用的手段之一[10，20]。目前對于藍莓生物活性研究，包括黃酮、色素、多酚等，均采用傳統(tǒng)的有機溶劑提取法，但此種方法測定的活性成分含量與人體消化吸收的含量之間存在著較大的差異，不足以準(zhǔn)確反映藍莓營養(yǎng)成分的實際價值，鄭影已對不同提純度的藍莓模擬消化后的抗氧化進行了研究[4]。任何一種生物活性物質(zhì)在發(fā)揮其作用之前，都要經(jīng)過人體的胃腸道消化，而消化也會對多酚化合物的生物活性產(chǎn)生影響。尤其是藍莓皮渣中的活性成分豐富，因此本文采用了體外消化法對藍莓皮渣活性成分和抗氧化活性進行了研究。

本研究結(jié)果表明，多酚、花色苷等活性成分經(jīng)胃消化后含量顯著升高，3個不同劑量樣品組中多酚、花色苷和黃酮釋放量在消化0.5 h內(nèi)顯著升高，這可能是由于部分蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下水解為小分子多肽，從而被大分子蛋白質(zhì)包圍的多酚被釋放出來；或胃蛋白酶減弱了部分酚酸與細胞壁間的酯鍵，使酚酸從細胞壁中脫離；也可能是胃蛋白酶破壞了多酚—蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得多酚脫離了蛋白質(zhì)分子的束縛[22]。對照組中的花色苷和多酚活性成分消化前后無顯著差異，可見酸堿環(huán)境對他們的釋放無明顯影響，胃蛋白酶和胃酸對黃酮的釋放均具有一定的作用。而從酸性的胃環(huán)境過渡到溫和的堿性腸道環(huán)境中，由于pH值的變化，會造成生物可利用多酚，尤其是花色苷減少。模擬腸道環(huán)境的酶可能作用于結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)，中性或偏堿性多酚可以在腸液介質(zhì)中穩(wěn)定存在（如槲皮素），而酸性多酚大量降解或異構(gòu)為其它堿性條件下穩(wěn)定的形式，在腸道中各活性成分的多少也就取決于其釋放量和降解量的高低。本試驗中藍莓皮渣粗提物中黃酮比多酚和花色苷在腸液中穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)顯著的降低，雖然黃酮仍屬于多酚，但沒有在多酚中表現(xiàn)出來，有可能是消化過程中釋放的黃酮類物質(zhì)占多酚的總含量比較少，或者黃酮降解、轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的物質(zhì)不影響多酚含量的測量。粗提物在模擬消化過程中抗氧化活性的變化規(guī)律與多酚的釋放規(guī)律基本一致，雖然腸道中黃酮的量較高，但可能其在消化過程中的釋放增加不足以引起抗氧化活性的顯著變化。由于原材料本身物質(zhì)的不同，各活性成分含量及抗氧化活性在模擬消化過程中的變化情況不完全一樣。但為了能深入分析藍莓皮渣經(jīng)胃腸消化后釋放出的活性成分否被人體吸收，還需要利用細胞模型和動物模型來做進一步的研究。

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